HPLC法測(cè)定醬油中苯甲酸、山梨酸的含量及六省醬油樣品測(cè)定結(jié)果分析

張國(guó)躍 喬蓉霞 齊化元

（1.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所，陜西西安710061；2.陜西省衛(wèi)生監(jiān)督所，陜西西安710054）

醬油是我國(guó)使用最廣的調(diào)味品之一，由于醬油營(yíng)養(yǎng)豐富，適于微生物生長(zhǎng)繁殖，為了防止醬油腐敗變質(zhì)，保持醬油的鮮度和良好的品質(zhì)，醬油中一般都會(huì)添加防腐劑苯甲酸、山梨酸。隨著現(xiàn)代食品工業(yè)的發(fā)展，食品添加劑的超量和超范圍使用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，對(duì)食品添加劑的檢測(cè)也越來(lái)越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定醬油中苯甲酸、山梨酸的含量，方法簡(jiǎn)便、快捷，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)。本次試驗(yàn)共收集到六個(gè)省份共計(jì)180批樣品（每省30批），測(cè)定結(jié)果表明，六個(gè)省份醬油中均有不同程度添加苯甲酸、山梨酸的情況。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀，2487紫外檢測(cè)器，Waters empower工作站（美國(guó)Waters公司），C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；Sartorius AGME235S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 對(duì)照物質(zhì)

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，GBW（E）130035 2008-3）、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，GBW（E）100007 09002），均由中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供。

1.3 試劑及試液

試驗(yàn)用水：符合GB/T 6682-92二級(jí)水標(biāo)準(zhǔn)；甲醇：色譜純，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾；其它試劑均為分析純。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

1.4.1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取苯甲酸約0.10g，加碳酸氫鈉溶液（20g/L）5mL，加熱溶解，移入100mL量瓶中，加水定容至100mL，苯甲酸含量約為1mg/mL，作為儲(chǔ)備溶液。

1.4.2 山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，GBW（E）100007 09002，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院提供，濃度：1.00mg/mL。

1.4.3 苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)混合使用液 精密吸取苯甲酸、山梨酸各10.0mL，放入100mL量瓶中，加水至刻度。此溶液含苯甲酸、山梨酸各0.1mg/mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.5 試樣處理

稱(chēng)取本品5.0g，加水約40mL，用稀氨水調(diào)節(jié)pH值至約7，加水定容至50mL量瓶中，離心，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

1.6 高效液相色譜條件

色譜柱：C18250mm×4.6mm，5～10μm；流動(dòng)相：甲醇∶0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)：230nm。

2 方法與結(jié)果

2.1 線(xiàn)性范圍考察

分別精密吸取苯甲酸、山梨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.102mg/mL、0.100mg/mL）2μL、5μL、10μL、15μL、20μL、30μL，按上述色譜條件，注入高效液相色譜儀測(cè)定，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，回歸方程分別為Y=3E+06X-80251，r=1；Y=5E+06X-158903，r=1。結(jié)果顯示，進(jìn)樣量在0.20396～3.50947μg和0.2～3.0μg范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，見(jiàn)圖1、2。

圖1 苯甲酸線(xiàn)性關(guān)系圖

圖2 山梨酸線(xiàn)性關(guān)系圖

2.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)測(cè)定7次，結(jié)果RSD%均為0.51%，表明精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品，分別在0、1、2、4、8、12h測(cè)定，計(jì)算含量的RSD%；取同一份樣品，分別在0、1、2、4、6、8、12、18h測(cè)定，苯甲酸、山梨酸含量的RSD%分別為0.78%、3.40%，穩(wěn)定性好。

2.4 空白試驗(yàn)

取不含苯甲酸、山梨酸的樣品按照1.4.1項(xiàng)下的方法制備試樣，測(cè)定，空白試樣中未出現(xiàn)與苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的色譜峰，見(jiàn)圖3。

圖3 高效液相色譜圖

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一樣品共6份，按照1.4.1項(xiàng)下的方法制備試樣，測(cè)定，計(jì)算RSD%。結(jié)果苯甲酸平均含量為0.8129mg/kg，RSD=1.24%；山梨酸平均含量為0.4784mg/kg，RSD=2.10%，見(jiàn)表1～2。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取上述樣品約2g，共6份，分別加入濃度分別為1.0198mg/mL和1.00mg/mL的苯甲酸、山梨酸對(duì)照品溶液各1mL，按照4.1項(xiàng)下的方法制備試樣，測(cè)定，結(jié)果苯甲酸平均回收率為98.31%，RDS=1.43%；山梨酸平均回收率為90.26%，RDS=2.82%，按下式計(jì)算回收率。見(jiàn)表3、4。

2.7 最低檢出濃度的確定

精密稱(chēng)取空白樣品約1g，將1.4.2項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度：苯甲酸0.1056mg/mL、山梨酸0.1mg/mL）稀釋10倍，在上述空白樣品中分別加入0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL，照1.4.1項(xiàng)下的方法制備試樣，結(jié)果在加入混合標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液1.0mL試樣中，檢測(cè)到與苯甲酸、山梨酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同的色譜峰，色譜峰面積分別為117481和130408，基線(xiàn)噪音信號(hào)為1.724，最低檢出濃度為苯甲酸0.21mg/kg，山梨酸0.20mg/kg。

表1 苯甲酸重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表2 山梨酸重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3 苯甲酸回收率測(cè)定結(jié)果

表4 山梨酸回收率測(cè)定結(jié)果

3 討論

此次檢測(cè)工作是按照國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局的統(tǒng)一部署所進(jìn)行的食品安全性評(píng)價(jià)工作，共采集到在安徽、湖南、湖北、福建、廣東、海南等六個(gè)省份流通環(huán)節(jié)使用的180批醬油樣品，涉及到生產(chǎn)企業(yè)43家。各省檢測(cè)到苯甲酸、山梨酸批數(shù)見(jiàn)表5。

結(jié)果顯示：苯甲酸含量在0.05～0.94g/kg；山梨酸含量在0.02～0.59g/kg。見(jiàn)圖4、5。

HPLC法測(cè)定醬油中苯甲酸、山梨酸的方法，樣品經(jīng)稀釋、調(diào)節(jié)pH后定容，處理方法簡(jiǎn)單、快捷[1]，但有些樣品由于濃度大、顏色深（如老抽類(lèi)醬油），稀釋后的顏色仍然較深，黏度偏大，可做進(jìn)一步稀釋[2-4]。在進(jìn)行大批量樣品測(cè)定時(shí)，注意色譜柱的保護(hù)，可每測(cè)定一定量的樣品后，進(jìn)行反沖，避免色譜柱過(guò)早毒化。張冬青[5]研究將樣品經(jīng)酸化后，用乙醚定量提取，然后取—部分提取液蒸發(fā)乙醚后定量溶解，再進(jìn)行液相色譜測(cè)定。該方法提純效果較好，具有處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、易用于實(shí)際樣品的測(cè)定，可用于在測(cè)定峰附近有雜質(zhì)峰樣品的測(cè)定[6]。

表5 各省檢測(cè)到苯甲酸、山梨酸批數(shù)

圖4 苯甲酸含量頻數(shù)分布圖

圖5 山梨酸含量頻數(shù)分布圖

[1]衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所.食品中山梨酸苯甲酸的測(cè)定方法[S].GB/TT5009.29-2003.

[2]國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1997：378.

[3]李明元.高效液相色譜法及其在食品分析中的應(yīng)用[M].北京：北京大學(xué)出版社，1988：54.

[4]王晶.食品安全快速檢測(cè)技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002.

[5]張冬青.采用高效液相色譜法同時(shí)快速測(cè)定醬油中的苯甲酸鈉、山梨酸[J].中國(guó)調(diào)味品，1997,10（22）：28-30.

[6]辛丹敏.高效液相色譜法在食品分析和藥物分析中的應(yīng)用研究[D].西南大學(xué)，2009：26-28.