帕米磷酸鈉對(duì)成骨不全成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖分化的研究

李公超 任秀智 王延宙 魯艷芹 徐 超 韓金祥

1.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東省現(xiàn)代醫(yī)用藥物與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250062；2。天津醫(yī)院，天津 300211；3 山東省省立醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250033

雙磷酸鹽是抑制破骨細(xì)胞活性的強(qiáng)有力的骨吸收抑制劑，在臨床上被廣泛應(yīng)用于骨質(zhì)疏松，骨肉瘤等病理性骨量丟失疾病。最近幾年雙磷酸鹽類藥物開始應(yīng)用于成骨不全的臨床治療中。成骨不全（Osteogenesis Imperfecta）是一種由于間充質(zhì)組織發(fā)育不全，膠原形成障礙而造成的先天性遺傳性疾病，其發(fā)病率大約是1/ 10000[1]。其主要臨床表現(xiàn)是青少年骨質(zhì)疏松，骨脆性增加，易于骨折。目前針對(duì)成骨不全癥手術(shù)治療后的藥物輔助治療主要是采用雙磷酸鹽類藥物。目前對(duì)雙磷酸鹽類藥物作用機(jī)理的研究大多針對(duì)正常的成骨細(xì)胞或者成骨細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)采用體外原代培養(yǎng)的成骨不全患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，取髖關(guān)節(jié)脫位患者原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為對(duì)照，研究第二代雙磷酸鹽帕米磷酸鈉對(duì)成骨不全患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖分化功能的影響，探討其在成骨不全癥治療中與臨床治療骨質(zhì)疏松及骨肉瘤等疾病的異同性，為進(jìn)一步探討帕米磷酸鈉在成骨不全癥的藥物治療中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 帕米磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品；膠原酶I（sigma）；青鏈霉素、胰蛋白酶、培養(yǎng)液DMEM（Gibco公司）；胎牛血清；地塞米松；Trizol（invitrogen）堿性磷酸酶染色試劑盒（碧云天）；ALP活性檢測(cè)ELISA試劑盒；MTT（QIAGEN公司）；倒置顯微鏡；酶免疫檢測(cè)儀；CO2培養(yǎng)箱；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 1.2.1 細(xì)胞分離與培養(yǎng) 經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及受試者知情同意，術(shù)中取成骨不全患者和髖關(guān)節(jié)脫位患者股骨松質(zhì)骨和大腿皮膚組織，分別至于含20ml無血清DMEM培養(yǎng)液（含10%青鏈霉素）。無菌條件下，取組織置于直徑6cm一次性培養(yǎng)皿中，PBS清洗兩遍除凈血液，清除骨膜、血管及骨縫等結(jié)締組織，剪碎骨組織至1mm×1mm大小, PBS液充分沖洗。膠原酶I 37℃消化5h， 離心去上清, 沉淀的細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液, 吹打成細(xì)胞懸液，置于25cm2 培養(yǎng)瓶中在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用第三代成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。

1.2.2 成骨細(xì)胞鑒定 取原代培養(yǎng)的第三代成骨不全患者和髖關(guān)節(jié)患者成骨細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)滿約85%時(shí)傾去培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍，95%乙醇固定10min，堿性磷酸酶染色試劑盒染色液37℃避光孵育15min，傾去染色液PBS清洗兩遍，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 藥物配制及分組 帕米磷酸鈉粉末用PBS溶解，0.1N NaOH調(diào)整PH值至7.4，過濾除菌，儲(chǔ)備液濃度為10-2M。取儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋至實(shí)驗(yàn)所需藥物濃度10-3M-10-10M。設(shè)地塞米松濃度為10-9M為陽性對(duì)照。

取三例原代培養(yǎng)的成骨不全患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以三例原代培養(yǎng)的髖關(guān)節(jié)脫位患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為正常對(duì)照組。

1.2.4 細(xì)胞增殖測(cè)定(MTT法) 取傳代至3代得實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以2x103/孔的密度鋪板于96孔板中。每孔加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液200ul，細(xì)胞過夜貼壁后更換含藥培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組換地塞米松培養(yǎng)基，對(duì)照組換普通培養(yǎng)基，每個(gè)濃度4個(gè)復(fù)孔，于加藥后48h和72h進(jìn)行MTT檢測(cè)，每孔加入20μ lMTT(5mg/ml)，37℃孵育15min和30min后在酶免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，波長(zhǎng)490nm，取其均值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。以藥物濃度為橫軸，細(xì)胞增殖率為縱坐標(biāo)繪制折線圖。

1.2.5 堿性磷酸酶活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞以1x104/孔的密度鋪板于24孔板中，每組每例樣本兩種細(xì)胞各鋪一板。細(xì)胞過夜貼壁后更換相應(yīng)藥物培養(yǎng)基，每個(gè)濃度2個(gè)復(fù)孔，加藥后72h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液凍存與-20℃，貼壁細(xì)胞用PBS清洗2遍，加80ul Trizol充分裂解細(xì)胞收集裂解液。實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞每個(gè)復(fù)孔各取20ul細(xì)胞裂解液用于ELISA檢測(cè)，酶免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，波長(zhǎng)450nm，取其均值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP活性值，以藥物濃度為橫坐標(biāo)軸，ALP活性值為縱坐標(biāo)繪制ALP活性變化折線圖。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS12.0軟件處理,應(yīng)用方差分析以及Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)及鑒定 成纖維細(xì)胞剛貼壁時(shí)呈長(zhǎng)梭形或多邊形（圖1），細(xì)胞貼壁后7-10天長(zhǎng)滿（圖2），10-14天細(xì)胞成簇狀集落生長(zhǎng)（圖3）。成骨細(xì)胞貼壁后呈短梭形、三角形或多邊形。堿性磷酸酶染色后大部分細(xì)胞被染成暗紅色（圖4），成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶染色后，只有很少量細(xì)胞被染成淡紅色（圖5）。

2.2 細(xì)胞增殖檢測(cè) 藥物作用48h后，細(xì)胞增殖差異多數(shù)不顯著（P>0.05）,72h時(shí)各濃度間差異顯著（表1），顯著性P<0.01。

當(dāng)藥物濃度為10-3M，10-4M時(shí)，均抑制實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩種細(xì)胞的增殖。成骨不全成纖維細(xì)胞最佳增殖濃度為10-6M，成骨細(xì)胞最佳增殖濃度為10-8M。對(duì)照組成纖維和成骨細(xì)胞最佳增殖濃度分別為10-5M和10-7M。72h時(shí)各細(xì)胞增殖率對(duì)應(yīng)藥物濃度變化曲線見表2，表3。

表1 不同濃度藥物處理對(duì)細(xì)胞增殖率的影響（±s，n=3）

表1 不同濃度藥物處理對(duì)細(xì)胞增殖率的影響（±s，n=3）

濃度 10-3M 10-4M 10-5M 10-6M 10-7M 10-8M 10-9M 10-10M 地塞米松實(shí)驗(yàn)組FB (-14.4±1.3)% (-9.7±1.2)% (25.7±0.4)% (37.7±1.2)% (18.9±1.9)% (16.0±0.9)% (10.8±1.5)% (0.2±0.03)% (11.4±0.9)%實(shí)驗(yàn)組OB (-20.4±0.4)% (-12.1±1.4)% (12.9±0.9)% (20.8±0.3)% (34.5±0.7)% (42.8±0.4)% (14.6±0.6)% (13.9±0.5)% (13.8±0.3)%對(duì)照組FB (-11.5±0.2)% (-8.4±0.6)% (27.1±0.7)% (18.2±0.7)% (13.8±0.5)% (7.7±0.4)% (4.3±0.1)% (0.17±0.01)% (5.6±0.3)%對(duì)照組OB (-13.1±0.4)% (-4.7±0.4)% (13.7±0.7)% (22.5±0.4)% (36.7±0.4)% (32.4±0.5)% (16.4±0.3)% (15.7±0.7)% (11.8±0.5)%

表2 藥物作用72h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成纖維細(xì)胞不同濃度下增殖率比較

表3 藥物作用72h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成骨細(xì)胞不同濃度下增殖率比較

表4 不同濃度藥物處理72h對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響（ALP濃度U/L ±s，n=3）

表4 不同濃度藥物處理72h對(duì)細(xì)胞ALP活性的影響（ALP濃度U/L ±s，n=3）

濃度 10-3M 10-4M 10-5M 10-6M 10-7M 10-8M 10-9M 10-10M 地塞米松 對(duì)照實(shí)驗(yàn)組FB 9.2±0.1 12.8±0.2 26.0±0.1 35.6±0.2 24.9±0.4 23.9±0.2 20.3±0.2 18.2±0.2 31.1±0.4 17.4±0.3實(shí)驗(yàn)組OB 24.2±0.4 30.2±0.6 65.3±0.8 72.4±0.5 95.0±0.8 101.9±0.6 66.8±0.9 60.7±0.5 84.6±0.3 38.6±0.4對(duì)照組FB 11.9±0.2 15.6±0.3 34.6±0.3 28.8±0.6 25.1±0.7 22.9±0.2 18.8±0.2 16.1±0.2 31.3±0.1 17.8±0.2對(duì)照組OB 31.4±0.4 39.9±0.3 56.9±0.7 60.5±0.5 100.5±0.7 88.6±0.5 58.3±0.2 56.8±0.3 77.6±0.7 50.1±0.1

表5 藥物作用72h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成纖維細(xì)胞不同濃度下ALP活性比較

表6 藥物作用72h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組成骨細(xì)胞不同濃度下ALP活性比較

2.3 細(xì)胞ALP活性檢測(cè) 兩組樣本兩種細(xì)胞經(jīng)藥物處理后，在一定濃度范圍內(nèi)細(xì)胞ALP活性均增強(qiáng)（表4）。

其中實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞ALP活性最高值對(duì)應(yīng)藥物濃度分別為10-8M和10-6M，而對(duì)照組兩種細(xì)胞ALP活性最高值對(duì)應(yīng)藥物濃度分別為10-7M和10-5M。以上兩組樣本兩種細(xì)胞ALP活性變化趨勢(shì)與細(xì)胞增殖趨勢(shì)相對(duì)應(yīng)，且各濃度間在藥物作用72h時(shí)差異顯著,顯著性P<0.01。各組細(xì)胞ALP活性比較見表5、表6。

3 討 論

雙磷酸鹽類藥物可降低骨轉(zhuǎn)換，抑制骨吸收，臨床上常被用于治療一些骨吸收亢進(jìn)疾病，如絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、Puget’s病等。以往對(duì)雙磷酸鹽的研究主要對(duì)破骨細(xì)胞的影響其對(duì)破骨細(xì)胞的影響機(jī)制主要是通過抑制破骨細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸通路的關(guān)鍵酶使胞內(nèi)的小G蛋白無法異戊二烯化，從而影響破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，促其凋亡[2]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)雙磷酸鹽可通過成骨細(xì)胞間接抑制破骨細(xì)胞[3,4]。Igarashi[5]等發(fā)現(xiàn)3種不同的二磷酸鹽在成骨樣細(xì)胞株MC3T3-E1中抑制內(nèi)生性前列腺素E2的產(chǎn)生,增強(qiáng)ALP的表達(dá)和礦化作用。Giuliani等[6]發(fā)現(xiàn)在鼠和人骨髓體外培養(yǎng)中, 二磷酸鹽刺激成骨細(xì)胞前體細(xì)胞和礦化小瘤的形成。目前，針對(duì)雙磷酸鹽對(duì)成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制探討主要集中對(duì)雙磷酸鹽引起的頜骨壞死疾?。˙RONJ）的探討中，研究者發(fā)現(xiàn)采用不同劑量的唑來膦酸處理成纖維細(xì)胞，其中高于10 μM濃度的唑來磷酸鹽即可引起成纖維細(xì)胞的程序性死亡，這種死亡機(jī)制部分是由胞內(nèi)的甲羥戊酸途徑介導(dǎo)的，而較低劑量的唑來磷酸鹽則促進(jìn)細(xì)胞增殖及IL-6，IL-8等細(xì)胞因子的表達(dá)[7]。Giuliani等[8]等發(fā)現(xiàn)雙磷酸鹽類藥物促進(jìn)集落生長(zhǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，采用三種含氮的雙磷酸鹽（伊班磷酸鹽、帕米磷酸鹽、唑來磷酸鹽）處理人成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，低劑量的藥物可促進(jìn)細(xì)胞活力和遷移能力[9]。成骨不全癥是由膠原合成相關(guān)基因突變導(dǎo)致的骨脆性增加，骨量丟失的遺傳性疾病，病人臨床體征呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松、肌無力、皮膚松弛等相關(guān)癥狀。從臨床對(duì)成骨不全術(shù)后應(yīng)用雙磷酸鹽藥物治療x光片顯示，患者干骺端骨骨密度增高，說明該藥物有利于患者骨質(zhì)增強(qiáng)，同時(shí)，由于患者膠原蛋白的缺失引起的皮膚松弛，疤痕體質(zhì)明顯等癥狀在適當(dāng)計(jì)量的雙磷酸鹽作用下也會(huì)有一定改善。

目前 ,對(duì)于雙磷酸鹽在體內(nèi)的濃度變化很難做到有效的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。有報(bào)道患者靜注帕米磷酸鈉后血液中的濃度可一過性達(dá)到10-5M[10],而在局部的骨吸收區(qū)域濃度更可高達(dá)10-3M[11]。本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度梯度（10-3M～10-10M）的帕米磷酸鈉作用于成骨不全癥患者原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，并以髖關(guān)節(jié)脫位患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為對(duì)照，研究結(jié)果顯示，帕米磷酸鈉對(duì)細(xì)胞的毒性作用在濃度≥10-4M時(shí)出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組兩種細(xì)胞最佳增殖濃度均比對(duì)照組兩種細(xì)胞低十倍，而且實(shí)驗(yàn)組兩種細(xì)胞增殖率均大于對(duì)照組，即實(shí)驗(yàn)組明顯的表現(xiàn)出對(duì)藥物劑量的敏感性高于對(duì)照組細(xì)胞。

ALP是骨形成所必需的酶,是識(shí)別和評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞分化程度的早期指標(biāo),其活性反映成骨細(xì)胞的活性。ALP可催化分解有機(jī)磷酸釋放無機(jī)磷，增加局部無機(jī)磷酸的濃度是啟動(dòng)礦化的必備條件。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)細(xì)胞增殖的藥物濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞ALP活性也有相應(yīng)的提高，且ALP活性最高值也對(duì)應(yīng)出現(xiàn)在細(xì)胞最佳增殖濃度。這說明一定劑量的帕米磷酸鈉可以促進(jìn)患者細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)，有利于患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的分化。

綜上所述，一定劑量濃度的帕米磷酸鈉可以促進(jìn)患者成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖并增強(qiáng)細(xì)胞ALP活性。但是，雙磷酸鹽類藥物針對(duì)成骨細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確，而且體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果只能給臨床該藥物的給藥劑量及給藥途徑提供一定的理論支持。真正意義上的兩者結(jié)合還需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來解決。

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