自然殺傷T細(xì)胞抗胞內(nèi)菌感染的研究進(jìn)展

孔曉明，劉勇

蚌埠醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，安徽省感染與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠 233030

自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell，NKT細(xì)胞)是一類介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫的免疫細(xì)胞，它們既表達(dá)T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)，又表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)記CD161(NK1.1)。NKT細(xì)胞能特異性識別非經(jīng)典的主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類樣分子CD1d呈遞的脂類抗原和蛋白質(zhì)抗原，活化后的NKT細(xì)胞能同時分泌T輔助細(xì)胞1(T helper cell type 1，Th1)和Th2兩類細(xì)胞因子，包括白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IL-4、γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等，同時激活下游多種其他免疫細(xì)胞，如樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體多種免疫效應(yīng)[1]。大量研究表明，NKT細(xì)胞在抗胞內(nèi)菌的感染免疫中發(fā)揮著重要作用。

1 NKT細(xì)胞的生物學(xué)特征

1.1 NKT細(xì)胞的分型

NKT細(xì)胞可分為Ⅰ～Ⅲ型：Ⅰ型NKT細(xì)胞大部分屬CD4+和CD4-CD8-一類，主要特征為CD1d限制性，TCR多樣性有限，只表達(dá)1條恒定的Vα14-Jα18鏈(小鼠)或Vα24-Jα18鏈(人)和1條Vβ鏈﹝包括Vβ8.2、Vβ7、Vβ2(小鼠)和Vβ11(人)﹞；Ⅱ型NKT細(xì)胞也表現(xiàn)為CD1d限制性，但表達(dá)多種TCR Vα鏈；Ⅲ型NKT細(xì)胞是CD1d非依賴性的，表達(dá)多種TCR Vα鏈，也稱NKT樣細(xì)胞[1]。

1.2 NKT細(xì)胞的檢測方法

目前對NKT細(xì)胞表型的確定仍存有爭議。常借助NK細(xì)胞譜系標(biāo)記(小鼠為NK1.1，人為CD161)及TCRα/β共表達(dá)來界定NKT細(xì)胞。常用CD161(人)與TCRα/β共表達(dá)、NK1.1(僅C57BL/6小鼠表達(dá))與TCRα/β共表達(dá)、DX5(NK1.1-小鼠)與TCRα/β共表達(dá)來標(biāo)記。CD1d四聚體的出現(xiàn)對 Ⅰ 型和 Ⅱ 型NKT細(xì)胞的研究起了極好的推動作用。α-半乳糖神經(jīng)酰胺 (α-galactosylceramide，α-GalCer)分子是目前與NKT細(xì)胞結(jié)合效能最強(qiáng)的糖脂抗原，能最大限度刺激NKT細(xì)胞產(chǎn)生Th1及Th2細(xì)胞因子[2]。應(yīng)用此糖脂及CD1d建立的CD1d四聚體技術(shù)已成為目前檢測NKT細(xì)胞的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。但Ⅲ型NKT細(xì)胞即NKT樣細(xì)胞，是CD1d非依賴性的，目前多采用DX5與TCRα/β共表達(dá)來界定。

1.3 NKT細(xì)胞的活化機(jī)制

不同于傳統(tǒng)的T細(xì)胞，NKT細(xì)胞的活化可能有2條途徑[4]：①直接識別微生物的脂類抗原，類似于傳統(tǒng)的MHC限制性T細(xì)胞的活化模式，即NKT細(xì)胞的TCR識別抗原呈遞細(xì)胞表面CD1d呈遞的微生物脂類抗原，如大腸埃希菌的磷酯酰乙醇胺、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的脂阿拉伯甘露糖等，經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路直接被活化。②微生物抗原間接刺激模式，即微生物抗原誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生某些因子(如IL-12、IL-18等)，這些因子能與NKT細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體結(jié)合，活化NKT細(xì)胞。有時該途徑也同時需要CD1d呈遞糖脂類抗原對TCR進(jìn)行激活。陳鈺等[5]研究發(fā)現(xiàn)，超抗原金黃色葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)也能活化NKT細(xì)胞，活化的NKT細(xì)胞亞群主要是CD8+NK1.1+和TCRVβ8+NK1.1+。

2 NKT細(xì)胞抗胞內(nèi)菌感染的免疫應(yīng)答作用

胞內(nèi)菌分為兼性胞內(nèi)菌和專性胞內(nèi)菌2類。兼性胞內(nèi)菌進(jìn)入機(jī)體后主要在胞內(nèi)寄居、繁殖；在體外，又能在無生命的培養(yǎng)基中生長。此類細(xì)菌有結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、傷寒沙門菌(Salmonellatyphi)、布魯桿菌(Brucellasp.)、肺炎軍團(tuán)菌(Legionellapneumonia)、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)等，多引起慢性感染。專性胞內(nèi)菌包括立克次體、柯克斯體、衣原體等，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長、繁殖。機(jī)體抵抗胞內(nèi)菌感染以細(xì)胞免疫為主。大量動物實(shí)驗(yàn)研究表明，NKT細(xì)胞在多種胞內(nèi)菌感染中發(fā)揮抗感染作用[6]。

2.1 胞內(nèi)菌與NKT細(xì)胞的活化

大量研究表明，胞內(nèi)菌能活化NKT細(xì)胞。如傷寒沙門菌細(xì)胞壁上的脂多糖[7]與DC共培養(yǎng)，能誘導(dǎo)NKT細(xì)胞分泌IFN-γ。該過程需DC表達(dá)的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR-4)、IL-4和CD1d參與，表明DC產(chǎn)生的IL-12能與NKT細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體結(jié)合，增強(qiáng)NKT細(xì)胞活化。大腸埃希菌脂多糖[8]活化NKT細(xì)胞只需IL-12和IL-18存在，而不需CD1d的呈遞。LM通過改變DC和巨噬細(xì)胞表面CD1d的表達(dá)來活化NKT細(xì)胞，該過程需由IFN-β介導(dǎo)[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，NKT細(xì)胞可識別分枝桿菌并產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答效應(yīng)。因?yàn)榉种U菌細(xì)胞壁的脂類和磷酯酰膽堿甘露糖苷能激活NKT細(xì)胞，分泌IFN-γ的CD4-CD8-NKT細(xì)胞還可通過釋放抗微生物的肽段(溶菌素)直接發(fā)揮抗分枝桿菌的作用[10]。傷寒沙門菌細(xì)胞壁上的脂多糖也能活化NKT細(xì)胞。

2.2 NKT細(xì)胞活化后發(fā)揮的抗感染能力

活化后的NKT細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，通過產(chǎn)生大量的IL-4、IFN-γ、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，或通過細(xì)胞間直接接觸的方式，作用于NK細(xì)胞、B細(xì)胞、DC和T細(xì)胞，從而調(diào)節(jié)整個免疫網(wǎng)絡(luò)。

Berntman等[11]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠口服感染沙門菌5 d后，NKT細(xì)胞活化，參與早期免疫應(yīng)答。其中分泌IFN-γ(發(fā)揮抗感染、抗腫瘤等機(jī)體保護(hù)功能)的CD4-CD8-NKT細(xì)胞增多，分泌IL-4(參與免疫調(diào)節(jié)，改善自身免疫性疾病的癥狀)的CD4+NKT細(xì)胞減少。Sada-Ovalle等[10]用感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞與清潔級C57BL/6小鼠的脾臟共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)上清液中IFN-γ分泌增加，且培養(yǎng)液中細(xì)菌減少。實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞能激活NKT細(xì)胞，活化后的NKT細(xì)胞能抑制結(jié)核分枝桿菌的復(fù)制，通過分泌IFN-γ識別并殺傷感染細(xì)胞。已證實(shí)，活化與未活化的NKT細(xì)胞均能保護(hù)宿主，抵抗結(jié)核分枝桿菌。Chiba等[12]發(fā)現(xiàn)，給予C57BL/6小鼠尾靜脈注射卡介苗(bacillus Calmette-Guerin，BGG)感染后，肝臟和脾臟的NKT細(xì)胞可活化(CD69表達(dá)上調(diào)，但NK1.1+NKT細(xì)胞減少)，分泌IFN-γ。該實(shí)驗(yàn)采用BrdU方法(淋巴細(xì)胞增生試驗(yàn))發(fā)現(xiàn)，在BCG感染早期(感染9 d內(nèi))，NKT細(xì)胞被激活并增殖；感染9 d后自適應(yīng)性應(yīng)答出現(xiàn)，NKT細(xì)胞開始衰落，通過Fas-FasL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生凋亡。Venkataswamy等[13]將NKT細(xì)胞活化劑α-GalCer注入到活的BCG中，發(fā)現(xiàn)α-GalCer-BCG能刺激DC成熟，并顯著增強(qiáng)特有的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，從而提高疫苗抗結(jié)核分枝桿菌的免疫保護(hù)效應(yīng)。

Emoto等[14]給予C57BL/6小鼠α-GalCer或?qū)φ找禾幚? d后，再通過腹腔注射LM感染1 h，檢測腹腔、肝臟和脾臟中菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)發(fā)現(xiàn)，α-GalCer能通過激活器官(不是腹腔)中的NKT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，從而加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌和噬菌作用，減輕LM感染。Emoto等[15]發(fā)現(xiàn)，給予感染LM的小鼠α-GalCer后，大量骨髓來源的Gr-1+(粒細(xì)胞譜系標(biāo)記)細(xì)胞及少量的γδ T細(xì)胞會迅速滲入肝臟，從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗LM感染作用。

2.3 NKT細(xì)胞活化后表型特征的改變

大量研究發(fā)現(xiàn)，NKT細(xì)胞活化后，表面NK1.1分子表達(dá)下調(diào)，TCRα/β表達(dá)也下調(diào)，下調(diào)的原因尚未明確。

Emoto等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在LM感染早期階段，NK1.1+NKT細(xì)胞顯著下降，NK1.1-NKT細(xì)胞顯著上升，以分泌IFN-γ為主。研究認(rèn)為,NK1.1+細(xì)胞是NK1.1-細(xì)胞的前體，NK1.1的丟失是為了清除抗原感染的細(xì)胞。

Emoto等[17]研究還發(fā)現(xiàn)，LM感染的肝臟NKT細(xì)胞表面NK1.1分子表達(dá)發(fā)生改變。在感染第4天，NK1.1分子表達(dá)下降；感染16 d后，NK1.1分子表達(dá)恢復(fù)到感染前水平。檢測胞質(zhì)TCRα/β(cTCRα/β)和細(xì)胞表面TCRα/β(sTCRα/β)發(fā)現(xiàn)，LM感染后NKT細(xì)胞的“丟失”很可能是因?yàn)門CRα/β的丟失或凋亡，但在LM感染的小鼠NK1.1+和NK1.1-NKT細(xì)胞群中檢測不到活化的半胱天冬氨酸酶3(Caspase-3)[17]。

Werner等[18]比較了NK1.1-BALB/c小鼠肝臟和脾臟的DX5+NKT細(xì)胞在表型和功能上的差異發(fā)現(xiàn)，NKT細(xì)胞活化后，會發(fā)生典型的TCRα/β表達(dá)下調(diào)及CD178(啟動死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Fas分子的配體)表達(dá)上調(diào)。

2.4 活化后的NKT細(xì)胞——連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁

活化后的NKT細(xì)胞幾乎對所有血細(xì)胞，包括NK細(xì)胞、DC、B細(xì)胞及T細(xì)胞均有作用，因此活化的NKT細(xì)胞是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁[19]。

Joyee等[20]將衣原體感染Jα18-/-基因敲除小鼠與野生型小鼠后，比較CD8α+DC與NKT細(xì)胞共培養(yǎng)后的IFN-γ產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)活化后的NKT細(xì)胞會優(yōu)先調(diào)節(jié)CD8α+DC的功能，從而引發(fā)天然免疫反應(yīng)。Choi等研究發(fā)現(xiàn)，在LM靜脈注射初次感染過程中，肝臟和脾臟的NKT細(xì)胞在感染第1天就被活化，表現(xiàn)為CD69表達(dá)上調(diào)；在感染第8天，通過分泌細(xì)胞因子(如IFN-γ、IL-12)，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為傳統(tǒng)性T細(xì)胞增加[21]。Fujii等[22]發(fā)現(xiàn)，NKT細(xì)胞被激活后，會激活下游的DC和NK細(xì)胞。DC會誘導(dǎo)NKT細(xì)胞持久分泌IFN-γ；而活化后的NKT細(xì)胞，其CD40表達(dá)上調(diào)，能通過CD40-CD40L的相互作用促使DC成熟，從而分泌IL-12，上調(diào)聯(lián)合刺激分子，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫捕獲胞內(nèi)抗原，以及延長聯(lián)合CD4和CD8 T細(xì)胞免疫殺菌作用。

3 結(jié)語

含有糖脂類抗原的胞內(nèi)菌，如大腸埃希菌和結(jié)核分枝桿菌，可直接活化NKT細(xì)胞；其他不含有糖脂類抗原的胞內(nèi)菌，可通過誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生某些因子(如IL-12)與NKT細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體結(jié)合，增強(qiáng)NKT細(xì)胞的活化?；罨蟮腘KT細(xì)胞經(jīng)分泌多種細(xì)胞因子發(fā)揮天然免疫反應(yīng)，并激活下游多種其他免疫細(xì)胞，如DC、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體多種免疫效應(yīng)。對活化后的NKT細(xì)胞表面TCRα/β和NK1.1的“丟失”機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] Bendelac A, Savage PB, Teyton L. The biology of NKT cells [J]. Annu Rev Immunol, 2007,25:297-336.

[2] Bai L, Sagiv Y, Liu Y, Freigang S, Yu KO, Teyton L, Porcelli SA, Savage PB, Bendelac A. Lysosomal recycling terminates CD1d-mediated presentation of short and polyunsaturated variants of the NKT cell lipid antigen alphaGalCer [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009,106(25):10254-10259.

[3] Watarai H, Nakagawa R, Omori-Miyake M, Dashtsoodol N, Taniguchi M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells[J]. Nat Protoc, 2008,3(1):70-78.

[4] Brigl M, Brenner MB. How invariant natural killer T cells respond to infection by recognizing microbial or endogenous lipid antigens [J]. Semin Immunol, 2010,22(2):79-86.

[5] 陳鈺, 鐘江, 徐健, 陳中才, 張繼慧, 金婷. 超抗原SEB活化的NKT細(xì)胞亞群及耐受功能的研究[J]. 免疫學(xué)雜志, 2009, (1):23-26.

[6] Emoto M, Emoto Y. Intracellular bacterial infection and invariant NKT cells [J]. Yonsei Med J, 2009,50(1):12-21.

[7] Nagarajan NA, Kronenberg M. Invariant NKT cells amplify the innate immune response to lipopolysaccharide[J]. J Immunol, 2007,178(5):2706-2713.

[8] Tupin E, Kinjo Y, Kronenberg M. The unique role of natural killer T cells in the response to microorganisms [J]. Nat Rev Microbiol, 2007,5(6):405-417.

[9] Raghuraman G, Geng Y, Wang CR. IFN-beta-mediated up-regulation of CD1d in bacteria-infected APCs [J]. J Immunol, 2006,177(11):7841-7848.

[10] Sada-Ovalle I, Chiba A, Gonzales A, Brenner MB, Behar SM. Innate invariant NKT cells recognize Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages, produce interferon-gamma, and kill intracellular bacteria [J]. PLoS Pathog, 2008,4(12):e1000239.

[11] Berntman E, Rolf J, Johansson C, Anderson P, Cardell SL. The role of CD1d-restricted NKT lymphocytes in the immune response to oral infection with Salmonella typhimurium [J]. Eur J Immunol, 2005,35(7):2100-2109.

[12] Chiba A, Dascher CC, Besra GS, Brenner MB. Rapid NKT cell responses are self-terminating during the course of microbial infection [J]. J Immunol, 2008,181(4):2292-2302.

[13] Venkataswamy MM, Baena A, Goldberg MF, Bricard G, Im JS, Chan J, Reddington F, Besra GS, Jacobs WR Jr, Porcelli SA. Incorporation of NKT cell-activating glycolipids enhances immunogenicity and vaccine efficacy of Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin [J]. J Immunol, 2009,183(3):1644-1656.

[14] Emoto M, Yoshida T, Fukuda T, Kawamura I, Mitsuyama M, Kita E, Hurwitz R, Kaufmann SH, Emoto Y. Alpha-galactosylceramide promotes killing of Listeria monocytogenes within the macrophage phagosome through invariant NKT-cell activation [J]. Infect Immun, 2010,78(6):2667-2676.

[15] Emoto M, Emoto Y, Yoshizawa I, Kita E, Shimizu T, Hurwitz R, Brinkmann V, Kaufmann SH. Alpha-GalCer ameliorates listeriosis by accelerating infiltration of Gr-1+cells into the liver [J]. Eur J Immunol, 2010,40(5):1328-1341.

[16] Emoto M. Liver invariant NKT cells and listeriosis [J]. Microbes Infect, 2008,10(9):1036-1040.

[17] Emoto M, Yoshizawa I, Emoto Y, Takahashi Y, Hurwitz R, Miamoto M, Kaufmann SH. Reversible NK1.1 surface expression on invariant liver natural killer T cells during Listeria monocytogenes infection [J]. Microbes Infect, 2007,9(14-15):1511-1520.

[18] Werner JM, Busl E, Farkas SA, Schlitt HJ, Geissler EK, Hornung M. DX5+NKT cells display phenotypical and functional differences between spleen and liver as well as NK1.1-Balb/c and NK1.1+C57Bl/6 mice [J]. BMC Immunol, 2011,12:26.

[19] Cerundolo V, Kronenberg M. The role of invariant NKT cells at the interface of innate and adaptive immunity [J]. Semin Immunol, 2010,22(2):59-60.

[20] Joyee AG, Uzonna J, Yang X. Invariant NKT cells preferentially modulate the function of CD8 alpha+dendritic cell subset in inducing type 1 immunity against infection [J]. J Immunol, 2010,184(4):2095-2106.

[21] Choi HJ, Xu H, Geng Y, Colmone A, Cho H, Wang CR. Bacterial infection alters the kinetics and function of iNKT cell responses [J]. J Leukoc Biol, 2008,84(6):1462-1471.

[22] Fujii S, Shimizu K, Hemmi H, Steinman RM. Innate Valpha14+natural killer T cells mature dendritic cells, leading to strong adaptive immunity [J]. Immunol Rev, 2007,220:183-198.