纖維素結(jié)合域的釀酒酵母表面展示及其黏附位點初探

張玉杰 王佳堃 葉均安 劉建新

(浙江大學奶業(yè)科學研究所,杭州 310029)

反芻動物通過瘤胃微生物發(fā)酵纖維素、半纖維素等結(jié)構(gòu)性碳水化合物滿足機體的能量需要。瘤胃微生物對纖維物質(zhì)的黏附是降解纖維的首要條件[1-2]。因此,微生物對纖維物質(zhì)的黏附一直是反芻動物營養(yǎng)研究的熱點之一。微生物對纖維物質(zhì)的黏附包括非特異性黏附和特異性黏附 2種形式,特異性黏附又以酶的纖維素結(jié)合域(cellulosebinding dom ain,CBD)研究得相對深入[3]。CBD是碳水化合物活性酶內(nèi)具有纖維素結(jié)合能力的高度折疊的一段氨基酸序列,目前的研究致力于CBD的應用[4-7]、蛋白質(zhì)和碳水化合物結(jié)合機制[8]等,較少涉及瘤胃優(yōu)勢纖維分解細菌。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogenes)是瘤胃內(nèi)主要的三大纖維分解細菌之一[9-11]。CAzy(http：//www.cazy.org)數(shù)據(jù)庫顯示,產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 S85的 CBD分屬于家族 2、6、11和 30,而這 4個家族在微生物中的分布并不均衡,很多細菌酶都具有 CBD2結(jié)構(gòu)域,突顯了 CBD2的重要性。CBD是高度折疊的氨基酸序列,傳統(tǒng)的研究方法難以應用于其研究。酵母表面展示技術(shù)是近年來發(fā)展較快的一種真核蛋白表達系統(tǒng),其基本原理是將外源靶蛋白基因與特定的載體基因序列融合后導入酵母細胞,利用酵母細胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)轉(zhuǎn)運到膜表面,從而使靶蛋白固定化表達在酵母細胞表面[12-13]。釀酒酵母對表達蛋白翻譯后修飾加工,易于培養(yǎng)、傳代穩(wěn)定[13],在研究 CBD的過程中無需分離、純化操作,而且表達的蛋白可通過特異性免疫組化進行靈敏而方便地檢測和篩選。為此,本試驗利用釀酒酵母展示技術(shù)展示產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的 CBD2,并通過特異性免疫組化反應分析 CBD 2纖維物質(zhì)的黏附位點,探討其重要性,為后續(xù)深入研究 CBD與瘤胃細菌特異性纖維黏附位點的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒、外源靶蛋白基因和植物材料

釀酒酵母 EBY 100和質(zhì)粒 pYD 1均由杭州師范大學陳振明副教授饋贈。Trans5α感受態(tài)細胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 S85的 CBD2與 pUC57質(zhì)粒的合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。稻草取自浙江大學試驗牧場。

1.1.2 酶與試劑

限制性內(nèi)切酶 Bam HⅠ和 XhoⅠ及 T4 DNA連接酶購于 Fermentas公司。核糖核酸酶 A(RNase A)、核酸分子質(zhì)量標準(500～15 000和100 bp)和割膠回收試劑盒購自于 TaKaRa公司。二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇 -3350(PEG-3350)、鮭魚精 DNA購于 Sigma公司。抗 V 5異硫氰酸熒光素標記抗體(Anti-V 5-FITC)購于 Invitrogen公司。其它生化試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.1.3 培養(yǎng)基和緩沖液

LB培養(yǎng)基：蛋白胨 10 g/L、酵母膏 5 g/L、NaCl10 g/L、瓊脂粉 15 g/L,用于 Trans5α培養(yǎng)。

LB氨芐青霉素固體選擇性培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(ampicillin)100 mg/L、瓊脂粉 15 g/L,用于重組質(zhì)粒的篩選。

酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、酵母膏 10 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂粉15 g/L,用于釀酒酵母 EBY 100培養(yǎng)。

無氨基酸酵母氮源 -酸水解酪素(YNBCAA)培養(yǎng)基 ：YNB 6.7 g/L、CAA 5 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉 15 g/L,用于轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)接或誘導。

MD轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基：YNB 6.7 g/L、亮氨酸0.1 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂粉 15 g/L,用于酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。

PEM緩沖液：哌嗪 -N,N′-雙(2-乙磺酸)(PIPES)50 mmol/L、乙二胺四乙酸 (EDTA)5 mm ol/L、M gSO45 mmo l/L,pH 6.9,用于稻草片固定。

磷酸鹽緩沖液(10mm ol/L)：NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L、Na2HPO41.44 g/L、KH2PO40.24 g/L,pH 7.4,用于稻草片的制備和孵育等。

1.2 重組質(zhì)粒 pMCBD2的構(gòu)建

在 LB氨芐青霉素固體選擇性培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),獲得含 CBD2基因的大腸桿菌 Trans5α單菌落。挑取單菌落 37℃,200 r/min過夜擴增,十二烷基硫酸鈉(SDS)堿裂解法抽提質(zhì)粒[14],Bam HⅠ和 XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒,電泳后割膠回收獲得CBD2基因序列。用同樣的方法獲得開環(huán) pYD1序列。將 2段序列經(jīng) T4 DNA連接酶連接后,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Trans5α,活化后涂布于 LB氨芐青霉素固體選擇性培養(yǎng)基。挑取篩選出的單菌落經(jīng)液體選擇性培養(yǎng)基擴增后,抽提質(zhì)粒,通過限制性酶切分析和測序(上海桑尼公司)驗證重組質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。

1.3 酵母轉(zhuǎn)化及誘導表達

采用醋酸鋰法[15]將構(gòu)建成功的質(zhì)粒 pMCBD2轉(zhuǎn)化釀酒酵母細胞 EBY 100,轉(zhuǎn)化后涂布于 MD培養(yǎng)基。挑取篩選出的單菌落,接種于 10 m L YNBCAA培養(yǎng)基中,30℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。待菌體生長到 OD600nm在 2～5時,5 000×g離心 5m in收集菌體。用 2%半乳糖的 YNB-CAA培養(yǎng)基重新懸浮菌體,使菌液 OD600nm為 0.5～1.0,20℃條件下 200 r/min搖床培養(yǎng) 6 h誘導基因表達。

1.4 稻草片的制備與酵母細胞孵育

改進 Wang等[16]和 McCartney等[17]的方法制備植物材料,并對其進行酵母細胞孵育。具體做法如下：取整株稻草,剝離莖、葉片和葉鞘,在莖的第二節(jié)上緣,節(jié)下 2厘米處截取長為 3厘米的莖片斷,縱切為 6份,水浸過夜后切割 100～300μm的橫切片斷。在含 4%多聚甲醛的 PEM緩沖液中固定 1 h后,用 10 mm ol/L磷酸鹽緩沖液沖洗。取1.5m L誘導表達的重組酵母細胞菌液,5 000×g離心 5m in獲得重組酵母細胞,用 10mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌細胞后,加入 250μL上述磷酸鹽緩沖液制得細胞懸液,與稻草片一起室溫條件下孵育1.5 h。

1.5 免疫組化反應

孵育后的稻草片用 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗 3次,以除去非特異黏附的酵母細胞。隨后用 1∶300稀釋的抗 V5異硫氰酸熒光素標記抗體處理稻草片 1.5 h,再用 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液清洗 3次后,熒光顯微鏡(尼康 ECLIPSS 80i)下檢測。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒 pMCBD2和重組菌株 pMCBD 2-EBY 100的構(gòu)建

pYD1是 5 009 bp的環(huán)狀 DNA,CBD2長為322 bp通過 pUC57攜帶。利用 Bam H I和 Xho I將目標 CBD2序列克隆至表面展示載體 pYD1的AGA 2 3′端,使 AGA 2-CBD 2融合基因處于 GAL1啟動子下游,構(gòu)建載體 pMCBD2,以實現(xiàn)半乳糖誘導下的高效表達(圖 1A)。

圖 1 pM CBD 2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of the recombinant p lasm id pMCBD 2

pMCBD 2和 pYD 1雙酶切圖譜均出現(xiàn)多個條帶,表明酶切不完全,但 2者比對可看到 pMCBD2攜帶了約 500 bp的片段(圖 1B)。

pMCBD 2單酶切僅獲得開環(huán)序列,測序分析的結(jié)果(圖 2)進一步證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組菌株 pMCBD2-EBY 100纖維黏附位點分析

因為 pYD1含有 V 5抗原表位,所以重組的pMCBD2-EBY 100酵母細胞在誘導表達后,可借助免疫組化,通過熒光監(jiān)測 CBD 2的纖維黏附位點。免疫組化結(jié)果顯示,未重組 CBD 2的 pYD 1-EBY 100不具有黏附稻草的能力(圖 3A),而重組的 pMCBD2-EBY 100對稻草的厚壁組織、薄壁組織和維管組織均有黏附。黏附程度隨稻草組織結(jié)構(gòu)的變化而不同,細胞相對致密的厚壁和維管組織的熒光強度大于細胞相對疏松的薄壁組織(圖 3B)。

3 討 論

釀酒酵母細胞壁蛋白 a凝集素有 2個亞基,其中 1個是 AGa2,AGa2-CBD2融合蛋白通過二硫鍵與釀酒酵母細胞壁蛋白 a凝集素的另一亞基AGa1蛋白結(jié)合,然后 AGa1蛋白通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)共價結(jié)合到細胞壁上。因為釀酒酵母EBY 100基因組中被整合了啟動子 gall-AGal開放閱讀框,所以 AGa2-CBD2融合蛋白能與充足的AGa1蛋白結(jié)合,使 CBD2在釀酒酵母細胞表面展示。

稻草的細胞壁在細胞發(fā)育過程中,由于原生質(zhì)體代謝活動不斷改變,所形成的壁物質(zhì)存在組成種類、數(shù)量、比例以及物理性質(zhì)的差異,使其在顯微鏡下呈現(xiàn)出自外而內(nèi)的胞間層、初生壁和次生壁的 3層結(jié)構(gòu)[18]。纖維素約占稻草細胞壁的60%,分布于初生壁和次生壁,且主要以微纖維組成的結(jié)晶形狀存在。半纖維素則主要是以木聚糖和葡萄糖醛酸的縮合物形式存在,且隨初生壁向次生壁木質(zhì)化程度減弱而減少[19]?；诮Y(jié)構(gòu)和功能差異,CBD2可劃分為 A和 B 2種類型。A型為黏附結(jié)晶纖維素,B型為黏附多聚糖鏈[8]。圖 4序列比對及圖 5利用 SW ISS-MODEL/SW ISS-Pdb-View er[20-22]預測的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的 CBD2具有 3個暴露于空間結(jié)構(gòu)外側(cè)的色氨酸(圖 4中黑框標出的“W”),且與第1個色氨酸相隔 2個位置的氨基酸為甘氨酸(圖 4中“＊”標出的“G”)。依據(jù)這一結(jié)果理論推測產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的 CBD2可能屬于類型 A[23],即該 CBD特異性地黏附結(jié)晶纖維素,而對木聚糖無黏附能力。這一推測與顯微鏡下觀察到產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的 CBD2對厚壁、薄壁和維管組織細胞均有黏附,且熒光強度與細胞壁的厚度一致相吻合(圖 3)。Blake等[24]以煙草莖為底物證實CBD2A細胞壁黏附范圍和強度高于 CBD1、CBD 3A、CBD10等,尤其是 CBD 2A可黏附木質(zhì)部的次生壁。上述結(jié)果表明利用酵母表面展示系統(tǒng)和免疫組化分析技術(shù)可研究瘤胃微生物 CBD的黏附特性。

圖 2 pM CBD 2與 CBD 2序列比對結(jié)果Fig.2 A comparison betw een sequences of pMCBD 2 and CBD 2

圖 3 免疫組化觀測 CBD 2在稻草莖橫切面上的黏附位點Fig.3 Immunohistochem isty detection of CBD 2binding locus on transverse sections o f straw stem

圖 4 CBD 2A多序列比對Fig.4 Sequence alignment of CBD 2A

圖 5 預測的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 CBD 2三維結(jié)構(gòu)Fig.5 A p rediction o f three dimensional structure of CBD 2 of F.succinogenes

4 結(jié) 論

本試驗利用釀酒酵母表面展示系統(tǒng)成功表達了產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 CBD2,免疫組化分析顯示產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌 CBD2的黏附位點廣泛,可黏附薄壁、厚壁和維管組織。釀酒酵母表面展示技術(shù)與免疫組化技術(shù)聯(lián)用研究瘤胃細菌 CBD的黏附位點是可行的。

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