一氧化氮及其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)

鄭 萍 田 剛 毛湘冰 余 冰 張克英 陳代文

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所,動(dòng)物抗病營養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,雅安 625014)

一氧化氮(NO)是由一氧化氮合成酶(NOS)以精氨酸為底物合成的內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子[1-3]。NO在各種生理過程中均起著重要的作用,包括調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞正常功能,維持血管舒張狀態(tài),削弱血小板激活和血栓的形成,阻止平滑肌增殖,抑制白細(xì)胞黏附及白細(xì)胞滲出,維持血細(xì)胞和血漿蛋白的滲透壓屏障[4-6]以及營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[7]等。作為 NOS的底物,精氨酸可以調(diào)節(jié) NOS的活性,進(jìn)而調(diào)節(jié) NO的合成,從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的代謝。依賴于精氨酸的 NO代謝途徑的發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì) NO的生物化學(xué)、生理學(xué)和營養(yǎng)學(xué)等方面的研究的極大興趣。關(guān)于 NO對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響,目前的研究主要集中在人的糖尿病、肥胖癥、高血脂癥或動(dòng)物模型中NO對(duì)葡萄糖、脂肪、氨基酸代謝的影響等方面。本文擬就 NO及其與養(yǎng)分代謝調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展做一綜述。

1 NO的合成

NO是由 NOS在輔助因子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、黃素單核苷酸(FMN)、四氫生物喋呤(BH4)、Ca2+和鈣調(diào)蛋白的作用下將精氨酸氧化分解而產(chǎn)生的[4,7]。如圖 1所示,NOS的黃素蛋白將 NADPH的電子轉(zhuǎn)運(yùn)給血紅素,血紅素活化并結(jié)合分子氧,BH4與 NOS緊緊結(jié)合,緊挨著血紅素,將底物精氨酸氧化分解為瓜氨酸和 NO[8]。BH4在 NOS的反應(yīng)中起結(jié)構(gòu)和氧化還原的作用。

圖 1 NOS催化反應(yīng)Fig.1 Catalytic reaction by NOS[9]

NOS有 3種亞型,神經(jīng)型(nNOS)——最早在神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn);誘導(dǎo)型(iNOS)——最早在巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞中由體外誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn);內(nèi)皮型(eNOS)——最早在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)[9]。nNOS和eNOS在各種類型的細(xì)胞中低水平地表達(dá),iNOS正常情況下在大多數(shù)細(xì)胞中不表達(dá),而受細(xì)菌毒素和炎癥因子的誘導(dǎo)高度表達(dá)[10]。它們廣泛存在于細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中。

NOS的亞型分別由 3種不同的基因編碼,其核苷酸序列有 51%～57%的同源性。NOS有 N端氧化酶和 C端還原酶 2個(gè)結(jié)構(gòu)域。N端氧化酶結(jié)構(gòu)域包含了精氨酸、血紅素、BH4的結(jié)合位點(diǎn)和將 L-精氨酸連接到 C端還原酶結(jié)構(gòu)域的鈣調(diào)蛋白識(shí)別位點(diǎn),C端還原酶結(jié)構(gòu)域包含了 FAD、FMN、NADPH的結(jié)合位點(diǎn),如圖 2所示。

圖 2 NOS的區(qū)域結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The structural domain of NOS[11]

2 NO與營養(yǎng)物質(zhì)代謝

NO不僅是脈管系統(tǒng)中重要的內(nèi)皮衍生因子,而且在營養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)控上有著重要的作用。目前研究較多的是在人的糖尿病、肥胖癥、高血脂癥患者或動(dòng)物模型中 NO對(duì)葡萄糖、脂肪、氨基酸代謝的影響方面。

2.1 NO與葡萄糖代謝

在糖尿病人或是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型上的研究表明,給予 NO合成底物后,能使患者或是糖尿病鼠的血糖濃度歸于正常。在用鏈唑霉素誘導(dǎo)的糖尿病鼠模型上的研究表明,添加 NO的合成底物精氨酸后,顯著增加了 NO的產(chǎn)量,并使糖尿病鼠的血糖濃度歸于正常[12]。給人和大鼠注射 NG-硝基 -L-精氨酸甲基酯(L-NAME,NOS競(jìng)爭性抑制劑)可以降低胰島素分泌,降低葡萄糖耐量[13-16]。給四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠飼喂富含精氨酸的椰子核蛋白 45 d后發(fā)現(xiàn),椰子核蛋白能顯著降低糖尿病大鼠血清中葡萄糖和胰島素的水平,肝臟糖原水平和血清碳水化合物代謝酶的活性回復(fù)到正常的水平,降低了糖尿病相關(guān)的胰腺損傷[17]。

Horton等[18]研究表明,在體外培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞中,添加 NO的供體增加 NO的產(chǎn)量后,能抑制乳酸鹽和丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化成葡萄糖,并且葡萄糖的合成量隨著 NO產(chǎn)量的增加呈劑量依賴的方式減少。Sprangers等[19]用分離大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn) NO能夠降低糖原合成酶的活性,從而抑制葡萄糖轉(zhuǎn)化為糖原。這些體外試驗(yàn)說明 NO能抑制肝臟葡萄糖和糖原的合成。在分離的大鼠骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)液中添加硝普鈉(SNP,一氧化氮供體)后發(fā)現(xiàn),葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)增加[20-21],骨骼肌細(xì)胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體 4(GLUT4)的濃度隨著 NO產(chǎn)量的增加而增加[22]。而在培養(yǎng)液中加入 NG-甲基 -L-精氨酸(L-NMMA,NOS競(jìng)爭抑制劑)后,NOS的表達(dá)受到抑制,進(jìn)而抑制 NO的合成,而此時(shí)發(fā)現(xiàn)因肌肉鍛煉刺激引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)減少[20]。在培養(yǎng)的 3T3-L1脂肪細(xì)胞中,添加 SNP促進(jìn)葡萄糖的吸收,而用 NO清除劑或腺苷環(huán)化酶抑制劑處理后,葡萄糖的吸收降低到基礎(chǔ)水平[23],說明 NO刺激葡萄糖吸收是通過 cGMP的途徑。給大鼠灌注 L-NMMA后,顯著降低了脂肪組織中葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。說明在骨骼肌和脂肪組織中,增加 NO的產(chǎn)量能增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收,抑制NO的生成則降低葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收。

關(guān)于 NO調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的信號(hào)途徑,總結(jié)目前的研究,歸納起來可能有 2條途徑。第一,依賴胰島素的途徑。在骨骼肌中,胰島素能促進(jìn)葡萄糖的吸收。胰島素是通過磷酸化磷脂酰肌醇 -3激酶(PI3K)來促進(jìn)葡萄糖吸收的,抑制了PI3K的活性(采用其抑制劑渥曼青霉素 wortmannin)后,就極顯著抑制了胰島素刺激的葡萄糖的吸收,顯著抑制了 NO刺激的葡萄糖吸收[22],說明NO刺激的葡萄糖吸收是部分依賴胰島素途徑的。第二,不依賴胰島素的途徑。鍛煉能增加大鼠肌纖維膜 GLUT4的含量及脈管 NO的產(chǎn)量[25-26],增加大鼠骨骼肌 eNOS和 iNOS的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)含量和活力[20,27-28],注射 L-NAM E后會(huì)鈍化這種作用[29]。L-NMMA處理后,可以抑制 NOS的表達(dá),減少因肌肉鍛煉刺激引起的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。但鍛煉時(shí)對(duì) PI3K活性無影響,說明鍛煉時(shí) NO對(duì)肌肉葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)作用不受胰島素的影響。另外有研究表明,活化 AMPK可促進(jìn)骨骼肌葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),增加 NOS的表達(dá),而添加 L-NAME后抑制了 AMPK的促葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[30],說明 AMPK調(diào)節(jié)的骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是依賴 NO的。

關(guān)于NO對(duì)葡萄糖氧化分解的作用研究結(jié)果不一致。用 SNP處理培養(yǎng)的大鼠比目魚肌細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)乳酸鹽分泌量和葡萄糖氧化以劑量依賴的方式增加[31-33]。而在培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞上,NO通過減少葡萄糖激酶和甘油醛 -3-磷酸脫氫酶的活性也能減少肝細(xì)胞糖酵解[34-35]。

高濃度的葡萄糖也會(huì)影響 NOS的活性和 NO的產(chǎn)量。在人臍靜脈上皮細(xì)胞的研究表明,高葡萄糖濃度(33 mm ol/L)的培養(yǎng)基中,NO的合成量顯著降低;進(jìn)一步研究表明,高葡萄糖抑制 eNOS的活性,補(bǔ)充精氨酸(800 mol/L)則抑制 eNOS活性的降低[36]。

2.2 NO與脂質(zhì)代謝

NO參與脂肪組織的生物學(xué)反應(yīng),影響脂肪的合成和分解。脂肪細(xì)胞中的 NO由 eNOS和 iNOS合成,在脂肪細(xì)胞中不表達(dá) nNOS基因或表達(dá)量很弱[37]。肥胖癥病人脂肪組織中 iNOS基因表達(dá)和NO產(chǎn)量較正常人高[38]。肥胖癥病人的 eNOS基因的表達(dá)也增加,但高產(chǎn)量的 NO主要是因?yàn)閕NOS。NO對(duì)脂肪代謝的作用根據(jù) NO的來源、供體、組織位點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)的氧化 -還原狀態(tài)不同而異[39-41]。體外試驗(yàn)的研究結(jié)果表明,在同一細(xì)胞中,不同的細(xì)胞狀態(tài),NO對(duì)脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用不同。大鼠脂肪細(xì)胞在低濃度的喘息平(isoprenaline)處理時(shí),添加嗎多明(molsidomine)或 SNP可促進(jìn)脂解;高濃度的喘息平處理時(shí),添加嗎多明或SNP則抑制脂解[42]。1～5μmol/L的 SNP促進(jìn)肥胖癥人脂肪組織的脂肪分解,但 25～500μmol/L的 SNP抑制脂肪分解[43]。體內(nèi)試驗(yàn)研究表明,NO在不同組織中對(duì)脂肪代謝調(diào)節(jié)的作用不同。在 110日齡的公豬飼糧中補(bǔ)充 1%的精氨酸,可顯著增加肌肉中脂肪酸合成酶的基因表達(dá),而降低脂肪組織中脂蛋白脂酶、GLUT4和ACC-α的基因表達(dá);此外,補(bǔ)充精氨酸還會(huì)降低脂肪組織中激素敏感脂酶的基因表達(dá)[44],這個(gè)試驗(yàn)說明補(bǔ)充精氨酸可以促進(jìn)豬肌肉組織中脂肪沉積,而在脂肪組織中則促進(jìn)脂肪分解。給成年ZDF大鼠補(bǔ)充 1.51%精氨酸鹽酸鹽,可以增加NO的產(chǎn)量(71%～85%),增加脂肪組織中脂肪分解(22%～24%),腹部和附睪體脂沉積分別降低了 45%和 25%[45]。給大鼠飼喂 0.02%的 L-Nω-硝基精氨酸(L-NNA,NOS抑制劑)8周后,發(fā)現(xiàn)大鼠體脂肪含量和血清甘油三酯含量顯著增加,而血清硝酸鹽的濃度顯著下降,并且,肝臟肉堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶(脂肪氧化的限速酶)的活性受到抑制,但補(bǔ)充了 4%的精氨酸后,L-NNA的作用被消除[46]。大鼠上的研究表明,NO能夠調(diào)節(jié)脂肪組織中瘦素對(duì)脂肪分解的刺激作用[47]。

NO可抑制低密度脂蛋白的合成。給兔子飼喂含 0.03%SNP的飼糧,有降低兔子血漿低密度脂蛋白的趨勢(shì);且在孵化的肝細(xì)胞中,添加 0.5%SNP可顯著降低 apoB的含量[48]。飼喂大鼠 NOS的抑制劑(L-NNA)后,血漿甘油三酯、膽固醇、極低密度脂蛋白水平顯著增加[46]。大鼠飼糧中添加0.02%NOS抑制劑(L-NNA)造成血漿脂肪酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白濃度顯著升高,飼糧中補(bǔ)充 4%的精氨酸后,由于 NOS抑制劑造成的高水平的血漿脂肪酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白濃度顯著下降[49]。NO調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝主要是通過抑制脂肪酸的從頭合成和乙酰輔酶 A羧化酶的活性,降低丙酰輔酶 A的水平,促進(jìn)脂肪酸氧化的[50]。

2.3 NO與氨基酸代謝

關(guān)于 NO對(duì)氨基酸代謝影響的研究比較少。目前關(guān)于 NO對(duì)氨基酸氧化的報(bào)道結(jié)果不一致。有報(bào)道認(rèn)為補(bǔ)充外源 NO(灌注 0.2 mmol/L的SNP)增加大鼠肝細(xì)胞尿素的生成,促進(jìn)其氨基酸的氧化[51]。但是,與炎癥條件下高水平的 NO相比,生理水平的 NO通過活化過氧化物酶體增生物激活受體 -α(PPAR-α)降低尿素循環(huán)的酶的表達(dá),抑制肝臟細(xì)胞尿素的合成,說明生理水平的NO有抑制肝臟氨基酸氧化的作用[52]。PPAR-α是肝臟尿素循環(huán)的負(fù)調(diào)節(jié)子,可下調(diào)氨甲酰磷酸合成酶 1、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OCT)、精氨基琥珀酸合成酶(ASS)和精氨基琥珀酸裂解酶(ASL)的表達(dá)[52]。

在 TNF-α誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌肌肉萎縮的模型上,NOS的抑制劑能促進(jìn)肌球蛋白肌酸磷酸激酶(myosin creatinine phosphokinase,MCK)的活化,抑制肌肉萎縮。在骨骼肌中,iNOS來源的 NO調(diào)節(jié) TNF-α對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制作用和刺激蛋白質(zhì)降解[53]。在血管平滑肌細(xì)胞中,外源 NO供體(30～300μmol/L)抑制鳥氨酸脫羧酶,從而抑制多胺合成和細(xì)胞增殖[54],但在內(nèi)皮細(xì)胞中,10μmol/L的 NO供體則增加多胺的合成和細(xì)胞增殖[55]。

3 NO合成的調(diào)控

NO影響營養(yǎng)物質(zhì)的代謝調(diào)控,因此調(diào)節(jié) NO的產(chǎn)量就能調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝。NO在生物體內(nèi)由 NOS合成,細(xì)胞中 NO的合成速率可通過各種途徑控制精氨酸的有效性及NOS的輔助因子來調(diào)節(jié)[56]。

鈣調(diào)蛋白是 3種亞型的 NOS活化所必需的[57-58]。iNOS不依賴于 Ca2+,因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)與鈣調(diào)蛋白緊密相連;eNOS和 nNOS的活化需要高濃度的 Ca2+,它們與 iNOS的不同在于它們的 C端還原酶區(qū)域有一個(gè)含 40～50個(gè)氨基酸的基序,阻止其與鈣調(diào)蛋白結(jié)合。磷酸化作用可影響 eNOS和 nNOS的活性[59],但 iNOS的活性不受磷酸化調(diào)節(jié),而受炎癥刺激的調(diào)節(jié)[60]。精氨酸在催化 NOS二聚體的形成中起到結(jié)構(gòu)性的作用[8,61]。精氨酸作為 NOS的底物,它還能通過底物調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)酶活性的機(jī)制來調(diào)節(jié) NOS活性[62]。由于 NO的合成受細(xì)胞類型、Ca2+-鈣調(diào)蛋白、亞細(xì)胞位點(diǎn)、磷酸化作用以及底物精氨酸濃度等多種因素的影響和調(diào)節(jié),而目前對(duì)具體的信號(hào)傳導(dǎo)途徑與最終的作用區(qū)域之間的關(guān)系還不清楚,因此,對(duì)于體內(nèi)NO的活性調(diào)節(jié)的研究仍然是巨大的挑戰(zhàn)。

4 小 結(jié)

精氨酸 -NO途徑在體內(nèi)有著重要的生理功能。NO不僅參與體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)代謝,而且是上皮衍生的作用于血管的一種調(diào)節(jié)介質(zhì)。NO具有擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)血流量、改善微循環(huán)及抗壞血小板聚集黏附及免疫調(diào)節(jié)功能,但 NO合成量過多會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性,所以,體內(nèi)適量水平的 NO對(duì)于人和動(dòng)物的健康是非常重要的[63-66]。

NO在生物體內(nèi)有著重要的生理作用,NO的產(chǎn)量、來源、作用的位點(diǎn)等因素均影響其生物學(xué)功能,而 NO的合成量受到 NOS活性的直接調(diào)節(jié)。NOS的活性又受到多種因素的影響。人和動(dòng)物模型研究表明,NO對(duì)人類高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、慢性腎衰竭、慢性心臟衰竭及癌癥等疾病進(jìn)程有著重要的調(diào)控作用。在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)上,動(dòng)物常常遭受免疫應(yīng)激或各種環(huán)境應(yīng)激,在應(yīng)激條件下,可能會(huì)誘導(dǎo) iNOS的表達(dá),合成大量的NO,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,同時(shí)會(huì)造成精氨酸被耗竭,產(chǎn)生營養(yǎng)缺乏癥等疾病。所以,進(jìn)一步研究 NO的作用機(jī)理、NOS的表達(dá)調(diào)控以及它與其他精氨酸代謝酶類和產(chǎn)物之間的交互關(guān)系有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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