豬藍(lán)耳病與圓環(huán)病毒混合感染的診斷

陳元坤，歐紅萍，劉宗秀，李猶平

（1.四川省新獸藥工程技術(shù)研究中心，四川 成都 611130；2.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都 611130）

1 流行病學(xué)

2011年3月，遂寧某豬場從外地引進(jìn)100多頭仔豬2周后，引進(jìn)豬和豬場原有母豬、仔豬同時發(fā)病，母豬發(fā)病率30%，死亡率10%左右，仔豬發(fā)病率90%，死亡率85%以上。豬場豬瘟的免疫已按正規(guī)免疫程序進(jìn)行，母豬在1年前免疫過經(jīng)典藍(lán)耳疫苗，3個月前曾采取血液進(jìn)行ELISA抗體測定，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典藍(lán)耳血清抗體水平異常偏高，未對高致病性藍(lán)耳病進(jìn)行免疫。

2 臨診癥狀

母豬體溫升高，在39.6～40.5℃，流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，有的死亡；仔豬體溫升高至40.2～41℃，呼吸急促，耳根、臀、尾、腹部皮膚呈紫紅色，發(fā)病后大量死亡。

3 剖解病變

死亡豬只剖解的主要病變在肺臟，肺嚴(yán)重出血、壞死、肉變、間質(zhì)增寬、呈暗紅色；肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)及腹股溝淋巴結(jié)腫大、出血；胃黏膜充血，有的潰瘍；腎臟出血并有明顯壞死灶；脾臟有少量出血。

4 實驗室PCR病原檢測

4.1 試驗材料 豬經(jīng)典藍(lán)耳病毒、高致病性藍(lán)耳病毒與圓環(huán)病毒陽性對照。豬經(jīng)典藍(lán)耳病毒陽性對照采用豬藍(lán)耳病弱毒活疫苗CH-1R株，高致病性藍(lán)耳病采用弱毒活疫苗TJM-F92株，均由遂寧市船山區(qū)畜牧局提供；圓環(huán)病毒陽性對照為北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

待檢測病料：為送檢的剖解病變典型的肺臟、淋巴結(jié)、腎、脾臟等冷凍2d的病料，送檢病料為2頭份。

引物：豬經(jīng)典藍(lán)耳病病毒基因序列參照李勇等設(shè)計合成的位于美洲型毒株ORF7，即N蛋白基因區(qū)內(nèi)，上游引物PRRS-F：5′-TAAATATGCCAAAAACAAC-3′，下游引物PRRS-R：5′-TAGGTGACTTAGAGGCACA-3′，擴(kuò)增片段長度為468bp。高致病性藍(lán)耳病毒基因引物參照范仲鑫等公開發(fā)表的引物序列，上游引物HPRRS-F：CGTAGAACTGTGACAACAAC，跨缺失區(qū)，對應(yīng)于變異株序列的2917-2936，下游引物HPRRSR：TGAGTATTTTGGGCGTGTGAT，對應(yīng)于變異株序列的3142-3162，目標(biāo)產(chǎn)物長度為246bp。豬圓環(huán)病毒Ⅱ型基因引物參照許秀梅等設(shè)計合成的序列，上游引物PCVⅡ-F：5′-TAGGTTAGGGC（A/T）（G/T）TGGCCTT-3′，下游引物PCVⅡ-R：5′-CCGCACCTTCGGATATAGTGT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為263bp。

分子生物學(xué)試劑：病毒RNA提取試劑盒，病毒DNA提取試劑盒，2×Taq PCR Mixture反應(yīng)試劑，標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker2000、標(biāo)準(zhǔn)DNA MarkerⅡ等均購自北京天根生物科技有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒為TOYOTA(日本東洋紡)產(chǎn)品。

4.2 試驗方法 取病料適量，剪碎后加適量生理鹽水研磨，8000r/min離心1min，取上清用于病毒RNA和DNA的提取，提取方法按試劑盒說明進(jìn)行。豬藍(lán)耳病、高致病性藍(lán)耳病RNA反轉(zhuǎn)錄體系和反轉(zhuǎn)錄程序為：病毒RNA 5μL，特異性下游引物1μL，dNTP mixture 2μL，RNase Inhibitor 1μL，Rever TraACE 1μL，5×RT Buffer 4μL，RNase free H2O 6μL，總共20μL；42℃，45min，99℃，5 min。反轉(zhuǎn)錄后按以下體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：ddH2O 7.5μL，cDNA/DNA 3μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Mixture 12.5 μL；94℃預(yù)變性3 min后，95℃ 30 s，藍(lán)耳病56℃、高致病性藍(lán)耳病52℃、圓環(huán)病毒Ⅱ62℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳，當(dāng)陽性對照和被檢樣品均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶時判定為陽性結(jié)果，反之為陰性。

4.3 試驗結(jié)果 豬經(jīng)典藍(lán)耳、高致病性藍(lán)耳與圓環(huán)病毒Ⅱ型提取病毒基因組在進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，陽性對照和被檢樣品均擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的條帶，豬經(jīng)典藍(lán)耳陽性對照及被檢樣品為468bp、高致病性藍(lán)耳陽性對照及被檢樣品為246bp，圓環(huán)病毒Ⅱ型陽性對照及被檢樣品為263bp左右，見圖1～圖3。結(jié)果表明被檢樣品中豬經(jīng)典藍(lán)耳、高致病性藍(lán)耳與圓環(huán)病毒Ⅱ型為陽性，陽性率100%。

圖1 經(jīng)典藍(lán)耳病毒PCR檢測結(jié)果

圖2 高致病性藍(lán)耳病毒PCR檢測結(jié)果

圖3 圓環(huán)病毒Ⅱ型PCR檢測結(jié)果

5 討論

藍(lán)耳病主要引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀，臨診特征與豬瘟及許多呼吸道疾病相似，單獨依靠流行病學(xué)資料、癥狀及剖檢病變還不能確診，需要進(jìn)一步的實驗室診斷。我們根據(jù)豬群的發(fā)病死亡情況、免疫狀況、臨診癥狀及剖解病變特征懷疑為藍(lán)耳病感染，同時由于豬場普遍存在圓環(huán)病毒的感染，所以我們對送檢病料進(jìn)行了經(jīng)典藍(lán)耳、高致病性藍(lán)耳和圓環(huán)病毒Ⅱ型的PCR檢測，結(jié)果3種傳染病的陽性檢測率為100%。

近年來，豬場傳染病混合感染是導(dǎo)致豬只死亡和造成經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。兩年來我們對豬場送檢病料的病原檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬場中藍(lán)耳病與圓環(huán)病毒的混合感染較普遍，受檢樣品中陽性率在90%以上，說明豬藍(lán)耳病和圓環(huán)病毒病仍是豬群中混合感染的原發(fā)性病原。此次送檢病料的豬場雖然免疫過經(jīng)典藍(lán)耳病疫苗，但由于缺乏科學(xué)的免疫程序和免疫后的抗體跟蹤監(jiān)測，導(dǎo)致免疫失敗而感染野毒，再加上未對高致病性藍(lán)耳病進(jìn)行免疫，最終同時暴發(fā)了經(jīng)典藍(lán)耳病與高致病性藍(lán)耳病，還混合感染了圓環(huán)病毒。因此，在做好豬場生物安全措施的同時，應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)匾卟×餍蟹N類和流行特征、豬只日齡、母源抗體水平情況來制定科學(xué)的免疫程序，并根據(jù)病情監(jiān)測結(jié)果隨時調(diào)整免疫程序，采用可靠的免疫方法和抗體監(jiān)測方法來預(yù)防此類傳染病的發(fā)生。

[1]李 勇，梅書棋，鄭 新，等.用RT-PCR對湖北省部分豬場豬繁殖與呼吸綜合癥的檢測[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，19（4）：363-365.

[2]范仲鑫，劉道新，何世成，等.湖南高致病性豬藍(lán)耳病隱性感染情況調(diào)查[C].第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會會議論文集，153-156.

[3]許秀梅，周緒斌，張馨玉，等.中等規(guī)模豬場保育豬圓環(huán)病毒病的實驗室診斷與控制 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33（12）：72-73.