奧美沙坦酯對心肌梗死小鼠NADPH氧化酶的作用

張 恒，劉是中

(中國醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)藥學(xué)院，沈陽110001)

體內(nèi)外研究表明，奧美沙坦酯(OLM)可以阻斷任何來源的血管緊張素Ⅱ所致的相應(yīng)生理作用［1］。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎冠狀動脈建立小鼠心肌梗死(MI)模型，應(yīng)用OLM進(jìn)行干預(yù)性治療，觀察各組動物的心肌纖維化情況、心肌丙二醛(MDA)含量及NADPH氧化酶組分的表達(dá)，探討OLM的抗氧化應(yīng)激作用及對MI后心臟的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 12周齡健康雄性清潔級C57小鼠40只，體質(zhì)量25～30 g，光照12 h/12 h明暗交替，室溫飼養(yǎng)，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 試劑及儀器 OLM(上海三共制藥有限公司，上海);MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);RNA提取試劑盒，cDNA合成試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，大連);Real-time PCR反應(yīng)試劑盒(Applied Biosystems，美國);引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上海);人工呼吸機(jī)(HX－100E型，成都泰盟科技有限公司，成都);酶標(biāo)光度計(jì)(SUNRISE RC，TECAN，瑞士)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立及分組 隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(SHAM組，n=8)、MI組(n=10)和OLM組(n =8)。各組小鼠按50 mg/kg腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，人工呼吸機(jī)輔助呼吸。迅速打開左前胸，暴露心臟。用7/0尼龍絲線在左心耳下方2 mm結(jié)扎冠狀動脈左前降支，顯微鏡下確認(rèn)，將心臟復(fù)位后擠壓出胸腔內(nèi)氣體，迅速縫合關(guān)閉胸腔，建立MI模型。SHAM組穿線而不結(jié)扎動脈，余步驟同MI、OLM組。SHAM組、MI組每天給予正常飼料和飲水，OLM組術(shù)后給予正常飼料和飲水的同時(shí)開始給予OLM 10 mg/(kg·d)灌胃。3組小鼠術(shù)后4周處死并檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2 MDA含量的測定 小鼠處死后取出心臟，并用冰生理鹽水洗凈，剪除左右心房、大血管及附著結(jié)締組織，取左心室(游離壁和室間隔)非梗死區(qū)組織稱重，按1∶9(w∶v)用玻璃勻漿器在4℃制備組織勻漿。3 000 r/min離心15 min，吸取上清待測。心肌組織蛋白定量用Bradford比色法。MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 病理學(xué)改變檢測 實(shí)驗(yàn)完成后取心臟組織，吸干表面水分，垂直于心臟左室長軸對稱中點(diǎn)平乳頭肌水平切取厚度為2～3 mm心臟切片，立即置于甲醛溶液中固定，石蠟包埋成蠟塊，切成3 μm切片，AZAN染色后光鏡下觀察結(jié)構(gòu)改變。

1.3.4 Real-time PCR法檢測 取各組心臟左心室非梗死區(qū)組織，按照試劑盒要求提取總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，應(yīng)用SYBR Green PCR master mix，在ABI Prism 7900T序列檢測系統(tǒng)檢測分析，反應(yīng)條件為20 μl反應(yīng)體系，按94℃ 30 s，然后94℃ 5 s，55℃ 5 s，72℃ 15 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，分析溶解曲線，計(jì)算gp91phox、p22phox和 p47phox樣本的相對濃度。PCR引物:gp91phox上游:5'-CTTTCTCAGGGGTTCCAGTG-3'，下游:5'-TCTTCCAAACTCTCCGCAGT-3';p22phox上游:5'-TGGACGTTTCACACAGTGGT-3'，下游:5'-TAGGCTCAATGGGAGTCCAC-3';p47phox上游:5'-CCACGG GTATTGCTAGGATGA-3'，下游:5'-AGACTAAGGCA GCGGGTAATCA-3';GAPDH上游:5'-CAACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'，下游:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACAC-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件包行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以s表示，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病死率及一般情況 SHAM組術(shù)后均存活，且一般情況佳;MI組病死率為20%，死因?yàn)樾牧λソ?，其余小鼠均不同程度出現(xiàn)呼吸急促、進(jìn)食和活動減少等情況;OLM組小鼠均存活，但有輕微的進(jìn)食、活動減少等情況出現(xiàn)。

2.2 MDA含量 SHAM組、MI組及OLM組心肌組織MDA水平分別為(11.4±1.21)、(27.3±4.18)及(17.8±2.35)nmol/mg prot，與SHAM組相比，MI組心肌組織MDA水平增高(P＜0.05);與MI組相比，OLM組MDA水平降低(P＜0.05)。

2.3 病理結(jié)果 AZAN染色結(jié)果可見SHAM組小鼠心肌肌肉束飽滿，排列整齊，染成鮮紅色。而MI組小鼠的心肌組織中梗死區(qū)藍(lán)染，心肌纖維消失，代之以纖維結(jié)締組織。OLM組亦可見藍(lán)染的纖維結(jié)締組織，但與MI組相比面積減少。

2.4 gp91phox、p22phox和p47phox mRNA表達(dá)見表1。

表2 不同組別心肌組織中g(shù)p91phox、p22phox和p47phox mRNA表達(dá)比較(n=8，s)

表2 不同組別心肌組織中g(shù)p91phox、p22phox和p47phox mRNA表達(dá)比較(n=8，s)

注:與SHAM組比較，*P＜0.05;與MI組比較，△P＜0.05

gp91phox p22phox p47phox SHAM組組別0.2±0.05 1.05±0.07 1.0±0.11 MI組 1.36±0.07* 2.15±0.14* 1.57±0.06* OLM組 0.45±0.09△ 1.65±0.09△ 1.23±0.09△

3 討論

體內(nèi)活性氧(ROS)被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的主要原因［2］，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化脂類等。雖然心臟中ROS來源廣泛，但研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶是產(chǎn)生ROS的重要來源［3］。NADPH氧化酶由2個(gè)膜結(jié)合成份(gp91phox和p22phox)，3個(gè)胞質(zhì)成份(p47phox、p67phox和p40phox)，以及1個(gè)小分子G蛋白(rac-1或rac-2)組成［4］。研究發(fā)現(xiàn)，NADPH氧化酶可催化O2產(chǎn)生超氧陰離子，后者可通過岐化作用生成過氧化氫，過氧化氫進(jìn)而能與超氧陰離子反應(yīng)生成羥自由基，如此產(chǎn)生的大量的ROS可以導(dǎo)致氧化與抗氧化水平的失衡而引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

在正常及病理?xiàng)l件下，NADPH氧化酶源ROS對決定細(xì)胞內(nèi)的氧化-還原平衡是至關(guān)重要的。心血管系統(tǒng)非吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶為組成性表達(dá)，可持續(xù)生成低水平的超氧化物。然而在生理及病理?xiàng)l件下，NADPH氧化酶也可產(chǎn)生爆發(fā)性超氧化物。目前認(rèn)為，NADPH氧化酶是心臟中超氧陰離子產(chǎn)生的最主要的調(diào)控酶之一［5］。研究顯示，MI后ROS產(chǎn)生增加與AngⅡ上調(diào)NADPH氧化酶密切相關(guān)，AngⅡ可與AngⅡ1型受體結(jié)合而激活NADPH氧化酶，啟動活性氧的生成［6］。隨著NADPH氧化酶活性表達(dá)的增加，氧化應(yīng)激的程度也隨之加重。

Yu等［7］報(bào)道使用AngⅡ受體阻斷劑可抑制心衰大鼠心肌氧化應(yīng)激水平及心室重構(gòu)。本研究中，我們的結(jié)果也顯示，MI后心肌發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一MDA含量及NADPH氧化酶組分表達(dá)顯著升高，應(yīng)用AngⅡ受體阻斷劑OLM后，MDA含量及NADPH氧化酶組分表達(dá)顯著降低，MI面積明顯減少，心肌損傷明顯減輕。說明OLM對NADPH氧化酶系統(tǒng)激活有良好的抑制作用。但是OLM未能完全抑制心臟氧化應(yīng)激的發(fā)展，說明NADPH氧化酶不是心臟ROS生成的惟一來源。詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

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