一些小麥品種Waxy蛋白亞基分析

任永康，張?zhí)m萍，張曉軍，唐朝暉，逯成芳

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西 太原 030031）

小麥品質(zhì)包括營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和加工品質(zhì)2個(gè)方面。營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)是指營(yíng)養(yǎng)成分的含量及其比例，特別是籽粒中蛋白質(zhì)含量及其各組分比例以及氨基酸的種類(lèi)和含量。加工品質(zhì)可分成磨粉品質(zhì)和食品加工品質(zhì)[1]。影響小麥?zhǔn)称芳庸ば阅艿男誀羁煞譃?類(lèi)，一類(lèi)是蛋白質(zhì)，包括蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量以及與此有關(guān)的面團(tuán)流變學(xué)特性等；另一類(lèi)是淀粉，主要包括直鏈淀粉含量（或直鏈淀粉/支鏈淀粉）和淀粉糊化特性等。蛋白質(zhì)是面粉烘烤品質(zhì)的決定因素[2]。

本研究利用1D-SDS-PAGE電泳技術(shù)對(duì)227份國(guó)內(nèi)外冬播小麥品種（系）進(jìn)行了Waxy蛋白亞基組成測(cè)定及分析，以期闡明我國(guó)小麥的淀粉特性，從而為改良小麥品質(zhì)提供依據(jù)和材料。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用的215份小麥品種（系）來(lái)自我國(guó)9個(gè)省市，其中山西省100份，河南省39份，河北省20份，山東省8份，江蘇省3份，陜西省16份，北京市20份，安徽省4份，四川省5份。這些材料是目前各地的主栽品種和優(yōu)良高代品系，代表了現(xiàn)階段我國(guó)小麥生產(chǎn)上推廣品種和育種材料的水平。此外還有12份國(guó)外材料。

選用已知Waxy蛋白亞基組成的10份材料作為對(duì)照，包括白火麥、USA、Kanto107和中國(guó)春及其相應(yīng)的6個(gè)缺體四體（N7AT7B，N7AT7D，N4AT4B，N4AT4D，N7DT7A和 N7DT7B）。

1.2 方法

Waxy蛋白亞基的電泳檢測(cè)參照王子寧等[3-4]的方法進(jìn)行，并在Waxy蛋白試劑配方、凝膠配方和電泳條件及銀染等方面作了適當(dāng)改進(jìn)。

1.2.1 Waxy蛋白的提取 將1粒種子用鉗子夾碎，放入1.5 mL離心管中，加入0.6 mL漂洗緩沖液，4℃浸泡過(guò)夜；用牙簽將種皮和大部分貯藏蛋白挑出；13000 r/min條件下離心4 min，棄上清液；加1 mL漂洗液，在旋渦混勻器上充分?jǐn)嚢瑁?3000 r/min條件下離心4 min，棄上清液，重復(fù)3～4次；加1 mL蒸餾水，在旋渦混勻器上充分?jǐn)嚢瑁?3000 r/min條件下離心4 min，棄上清液，重復(fù)1～2次；加1 mL丙酮，在旋渦混勻器上充分?jǐn)嚢瑁?3000 r/min條件下離心4 min，棄上清液，沉淀物自然干燥，于4℃保存。干燥的淀粉樣品以每5 mg加入0.1 mL提取液，在旋渦混勻器上充分?jǐn)嚢瑁毯蠓兴?5 min，趁熱在13000 r/min條件下離心10 min，然后取上清液25～40 μL進(jìn)行點(diǎn)樣。

1.2.2 SDS-PAGE凝膠制備及電泳

1.2.2.1 分離膠 按配方（表1）充分混勻各種溶液，灌入2塊玻璃板之間，并用水封膠。

表16 %SDS-PAGE凝膠配方 mL

1.2.2.2 濃縮膠 按配方（表1）充分混勻各種溶液，灌膠，并插入梳子。

1.2.2.3 點(diǎn)樣 待濃縮膠凝聚后，拔出梳子，每孔點(diǎn)樣25 μL，同時(shí)點(diǎn)上蛋白質(zhì)分子質(zhì)量Marker。

1.2.2.4 電泳 先用電壓130 V電泳，待指示劑進(jìn)入分離膠，電壓調(diào)至300 V。整個(gè)電泳進(jìn)行約5 h，指示劑跑出膠后45 min卸膠染色。

1.2.2.5 銀染 （1）固定。停止電泳后，將凝膠移入固定液中，在搖床上緩慢搖動(dòng)，固定20～30min。（2）水洗。傾去固定液，用蒸餾水清洗凝膠2次，每次5 min，緩慢搖動(dòng)。（3）銀染。傾去水，將凝膠浸泡在1～2 g/L的硝酸銀溶液中，在搖床上緩慢搖動(dòng)15～30 min。（4）水洗、顯色。傾去硝酸銀溶液，用蒸餾水快速清洗凝膠，并以少量顯色液快速洗滌1次，然后將凝膠浸泡在大量顯色液中，在搖床上緩慢搖動(dòng)，直至獲得滿(mǎn)意的條帶顯色強(qiáng)度。（5）停顯。傾去顯色液，將凝膠移入停顯液中，緩慢搖動(dòng)終止顯色10～20 min。（6）記錄。將凝膠移入蒸餾水中，照相或掃描并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 Waxy蛋白亞基的生化標(biāo)記

小麥Waxy蛋白亞基表達(dá)與否可作為生化標(biāo)記，本研究以日本品種Kanto107、美國(guó)品種USA和我國(guó)的白火麥、中國(guó)春（CS）及其6份缺體四體為對(duì)照，檢測(cè)Waxy蛋白亞基分析的正確性。

由表2可知，我國(guó)地方品種中國(guó)春3個(gè)Waxy蛋白亞基Wx-A1，Wx-B1和Wx-D1表現(xiàn)都正常。白火麥?zhǔn)枪J(rèn)的極少數(shù)只缺失Wx-D1蛋白亞基的品種。Kanto107是日本較老的栽培品種，它缺失了Wx-A1和Wx-B1這2個(gè)Waxy蛋白亞基，只有Wx-D1蛋白亞基。USA 3個(gè)Waxy蛋白亞基 Wx-A1，Wx-B1和 Wx-D1均缺失。N7AT7B和N7AT7D這2個(gè)中國(guó)春缺體四體由于缺少7A染色體，沒(méi)有Wx-7A基因，所以缺失Wx-A1蛋白亞基；N4AT4B和N4AT4D這2個(gè)缺體四體缺少4A染色體，沒(méi)有Wx-4A基因，缺失Wx-B1蛋白亞基；N7DT7A和N7DT7B這2個(gè)缺體四體不存在7D染色體，沒(méi)有Wx-7D基因，因此缺失Wx-D1蛋白亞基。對(duì)比以上品種的Waxy蛋白亞基的缺失狀況，可準(zhǔn)確地判斷出需要檢測(cè)的小麥材料Waxy蛋白亞基的組成。

表2 對(duì)照品種Waxy蛋白亞基的生化標(biāo)記

2.2 國(guó)內(nèi)外小麥品種（系）Waxy蛋白亞基分布

將國(guó)內(nèi)小麥材料Waxy蛋白亞基生化標(biāo)記的結(jié)果列于表3。由表3可知，在所研究的215份國(guó)內(nèi)品種（系）中，缺失Wx-B1蛋白亞基的品種（系）共有15份，占總數(shù)的7.0%。其中，山西省8份，占3.7%；河南省3份，占1.4%；河北省和北京市各1份，分別占0.5%；四川省2份，占0.9%；其他省市沒(méi)有缺失Wx-B1蛋白亞基的品種（系）。

表3 國(guó)內(nèi)各省小麥Waxy蛋白亞基的生化標(biāo)記

沒(méi)有檢測(cè)到除Wx-B1蛋白亞基缺失體外的其他Waxy蛋白的缺失類(lèi)型。同時(shí)，分析的12份國(guó)外小麥材料Waxy蛋白亞基中，有6份澳大利亞品種缺失Wx-B1蛋白亞基，這與我們對(duì)材料的選取方式有關(guān)，因?yàn)檫@6個(gè)品種，如Gameny等本身就是澳大利亞的優(yōu)質(zhì)面條小麥，早已被證實(shí)缺失Wx-B1蛋白亞基，部分國(guó)內(nèi)外品種Waxy蛋白亞基的電泳結(jié)果如圖1和圖2所示。

將本研究中檢測(cè)出的缺失Wx-B1蛋白亞基 的所有國(guó)內(nèi)外品種（系）列于表4。

表4 缺失Wx-B1蛋白亞基的品種（系）一覽

3 討論

Waxy蛋白亞基的缺失類(lèi)型在不同國(guó)家的差異較大[5-7]。本研究分析了國(guó)內(nèi)215份主栽品種和優(yōu)良高代品系，共篩選出15份缺失Wx-B1蛋白亞基的品種（系），占總數(shù)的7.0%，缺失比例不很高，并且沒(méi)有檢測(cè)到其他缺失類(lèi)型，缺失Wx-B1的比例高于姚大年等[7]的結(jié)果，但低于徐兆華等[8]的結(jié)果。需要說(shuō)明的是，各省市的缺失頻率差異較大，河南省、河北省、四川省和北京市的頻率較低（1.4%，0.5%，0.9%，0.5%），而山西省的頻率較高（3.7%）。各省市在分布頻率上的差異可能與取樣數(shù)量的不均有關(guān)，也和各省市在育種中所用親本的差異有關(guān)[9]。國(guó)內(nèi)小麥品種與國(guó)外相比，在主要淀粉特性上存在著較大的差距，澳大利亞優(yōu)質(zhì)面條小麥品種都缺失Wx-B1蛋白亞基[10]，因此，這些缺失品種或品系可作為親本用于淀粉特性和面條品質(zhì)的改良。

綜上所述，我國(guó)小麥淀粉特性的差異是比較大的，變異范圍較廣，存在一些缺失蛋白亞基的優(yōu)良種質(zhì)，今后只要注意加強(qiáng)淀粉品質(zhì)的育種和改良工作，選育出具有優(yōu)良淀粉品質(zhì)的小麥品種的可能性是比較大的。

［1］張建華，張定一，姬虎太，等.山西不同時(shí)期小麥品種的高分子量麥谷蛋白亞基組成分析 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（4）:39-41.

［2］ Payne P I，Corfield K G.Subunit composition of wheat glutenin protein isolated by gel filtration in a dissociating medium[J].Planta，1979，45:83-88.

［3］王子寧，郭北海，李洪杰，等.多倍體麥類(lèi)作物Wx蛋白檢測(cè)的 SDS-PAGE 方法[J].遺傳，2000，22（3）:169-171.

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［6］ Nakamura T，Yamamori M，Hirano H，et al.Decrease of Waxy（Wx）protein in two common wheat cultivars with low amylose content[J].Plant Breeding，1993，111:99-105.

［7］姚大年，王新望，劉志勇，等.小麥品種Waxy蛋白的鑒定和篩選[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1999，7（1）:1-9.

［8］徐兆華，夏蘭芹，陳新民.中國(guó)冬小麥品種Waxy蛋白分析及分子標(biāo)記研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（8）:1514-1521.

［9］王海萍，唐朝暉，劉少翔，等.山西冬小麥品種Waxy蛋白分析及分子標(biāo)記研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（1）:98-102.

［10］ZhaoX C，Sharp P J.Wheat‘waxy’proteins:SDS-PAGE separation and variation in Australian cultivars[C]//Proceedings of the 7th Wheat Breeding Society of Australia Assembly.Adelaide:WBSA，1994:253-256.