慢性阻塞性肺疾病下呼吸道細(xì)菌定植的動態(tài)變化與肺功能和痰細(xì)胞因子的關(guān)系

楊興慧，王浩彥

慢性阻塞性肺疾病 (chromic obstructive pulmonary disease，COPD)的患病率和死亡率均較高，社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)沉重，已成為重要的公共衛(wèi)生問題。它的主要特征是慢性氣流阻塞，并呈進(jìn)行性發(fā)展，伴有對氣道有害顆?；驓怏w的異常炎癥反應(yīng)。氣道慢性炎癥作為COPD發(fā)病和進(jìn)行性發(fā)展的中心環(huán)節(jié)已得到多數(shù)學(xué)者的認(rèn)同，但引起氣道慢性炎癥的病因和發(fā)病機制目前尚未完全闡明。近十幾年來，國內(nèi)外的一些研究證實，部分COPD患者的下呼吸道存在細(xì)菌［1－3］。下呼吸道細(xì)菌定植(lower airway bacterial colonization，LABC)是指在正常無菌的下呼吸道出現(xiàn)了持續(xù)存在的細(xì)菌，且不斷生長、繁殖，而不引起顯著的細(xì)菌感染的臨床癥狀。很多研究者發(fā)現(xiàn)部分穩(wěn)定期COPD患者氣道內(nèi)細(xì)菌定植與炎癥存在一定的關(guān)系。目前的研究多為橫斷面研究，關(guān)于下呼吸道細(xì)菌定植的動態(tài)變化與肺功能的縱向研究較少。本研究就COPD穩(wěn)定期患者是否存在LABC，LABC是否存在動態(tài)變化，LABC與氣道炎癥的關(guān)系及他們的肺功能變化進(jìn)行研究分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2007年12月—2008年2月北京友誼醫(yī)院門診就診的COPD患者。均符合2007年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會組織制定的COPD診治規(guī)范 (草案)中關(guān)于COPD的定義［4］，且均處于穩(wěn)定期。合并哮喘、肺栓塞等其他呼吸系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重心臟疾病、腫瘤、慢性消耗性疾病者均不入選。

1.2 方法

1.2.1 留取痰液 受試者清水漱口，先自行咳痰，若無痰，予0.9%氯化鈉溶液霧化吸入排痰，若仍無痰，再逐步予3%、4%、5%氯化鈉溶液霧化吸入排痰，每次間隔7 min，直至留取痰液約10 ml。取痰過程中若出現(xiàn)不適如喘憋、氣短、呼吸困難等，立即停止霧化吸入，休息、吸氧，吸入β2受體激動劑 (沙丁胺醇)［5］。將誘導(dǎo)的痰液置于無菌的痰盒中，鏡下觀察痰液標(biāo)本是否合格。

1.2.2 痰液處理 獲取痰液后1 h內(nèi)立即進(jìn)行培養(yǎng)。首先在痰液中加入稀釋的Sputosol液，作用20 min使痰液均質(zhì)化。Sputoso液與痰液的比例為1∶1，此1∶1懸液視為原液 (定量計算時加以校正)。預(yù)先準(zhǔn)備好4個無菌試管 (A、B、C、D管)，每管含0.9氯化鈉溶液4.5 ml。取原液0.5 ml置于A管中 (相當(dāng)于是10－1濃度)，再從A稀釋管中吸取0.5 ml置于B管中 (相當(dāng)于是10－2濃度)，如此依次稀釋，直到D管稀釋完畢。管內(nèi)痰液濃度依次為10－1～10－4。用10 μl接種環(huán)取各個濃度的痰液，分別密涂接種于血瓊脂平皿、麥康凱瓊脂平皿和巧克力瓊脂平皿。置于5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.3 檢測痰細(xì)胞因子 將原液痰標(biāo)本 (≥5 ml)用微量稱稱重，加4倍體積的新鮮配制的0.11%二硫蘇糖醇 (dithiothreitol，DDT)用吹管反復(fù)吹打，用振蕩器震蕩旋轉(zhuǎn)15 min，使之成為均勻的混懸液，將混懸液以48 μm的濾網(wǎng)過濾，再將過濾的混懸液放入離心機以790 g離心10 min，上清液分裝－80℃保存。采用雙抗體夾心法檢測痰液腫瘤壞死因子－α(TNF－α)、白細(xì)胞介素－8(IL－8)、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)。

1.2.4 肺功能測定 采用德國JAEGER公司的肺功能儀進(jìn)行常規(guī)通氣測定，記錄 FEV1、FEV1/預(yù)計值及 FEV1/FVC值。肺功能分級［4］:FEV1/預(yù)計值≥80%為Ⅰ級，80% ＞FEV1/預(yù)計值≥50%為Ⅱ級，F(xiàn)EV1/預(yù)計值＜50%為Ⅲ級。

1.2.5 隨訪 囑患者6個月后門診復(fù)診，同樣留取痰液，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，痰細(xì)胞因子測定及肺功能檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。LABC陽性組及LABC陰性組兩組的痰細(xì)胞因子，肺功能檢測值進(jìn)行比較，計量資料為正態(tài)分布，采用獨立樣本t檢驗的方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本狀況 共有入選患者34例，其中男31例，女3例，年齡 (64.71±9.48)歲，共完成68次測試。第1次FEV1為 (1.51±0.73)L，6個月后為 (1.44±0.69)L;FEV1/預(yù)計值 (%)第1次為 (65.80±30.37)，6個月后為(61.90±31.34);FEV1/FVC(%)第1次為(46.84±14.89)，第2次為 (47.71±13.24)。根據(jù)肺功能情況分級:第1次測試:Ⅰ級10例，占29.4%，Ⅱ級14例，占41.1%，Ⅲ級10例，占29.4%;6個月后第2次測試:Ⅰ級10例，占29.4%，Ⅱ級11例，占32.4%，Ⅲ級13例，占38.2%。

2.2 下呼吸道細(xì)菌定植的動態(tài)變化 第1次LABC陽性者10例，其中女2例，男8例，平均年齡 (60.90±9.81)歲;陰性者24例，其中男23例，女1例，平均年齡 (66.29±9.06)歲。第2次LABC陽性者10例，其中女1例，男9例，平均年齡 (62.17±10.42)歲;陰性者24例，其中男22例，女2例，平均年齡 (65.01±4.22)歲。有4例持續(xù)LABC陽性，有18例持續(xù)LABC陰性，有6例第1次LABC陽性而第2次LABC陰性，有6例第1次LABC陰性而第2次LABC陽性。

2.3 LABC與痰細(xì)胞因子濃度及肺功能變化的關(guān)系 將初始LABC陽性和由陰性轉(zhuǎn)為陽性的患者作為陽性組，持續(xù)陰性的患者作為陰性組。陽性組與陰性組的第1次和第2次的痰細(xì)胞因子TNF－α、IL－8、NE濃度相比較，陽性組較陰性組水平偏高，TNF－α、IL－8差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。肺功能陽性組較陰性組數(shù)值偏低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05，見表1)。

表1 兩組患者痰細(xì)胞因子、肺功能檢測結(jié)果比較 ()Table 1 Comparison the phlegm cytokines，pulmonary function testing results in the two groups

表1 兩組患者痰細(xì)胞因子、肺功能檢測結(jié)果比較 ()Table 1 Comparison the phlegm cytokines，pulmonary function testing results in the two groups

組別 例數(shù) TNF－α(pg/ml) IL－8(pg/ml) NE(ng/ml) FEV1(L) FEV1/pre(%) FEV1/FVC第一次陽性組 16 8.79±0.37 566.94±54.69 14.35±4.18 1.50±0.64 63.70±24.45 46.60±11.42陰性組 18 5.99±0.85 335.13±43.86 11.38±5.48 1.51±0.77 66.67±32.97 46.94±16.33第二次陽性組 16 7.57±0.23 445.80±36.29 15.12±4.44 1.44±0.60 61.85±34.59 41.80±11.58陰性組 18 6.67±0.24 210.94±26.54 13.22±3.37 1.44±0.73 62.00±23.29 49.08±10.14

3 討論

本研究結(jié)果證實，部分穩(wěn)定期COPD患者存在LABC，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果相同［1，3］。LABC可能與COPD的發(fā)病密切相關(guān)。健康人下呼吸道無菌有賴于正常完善的機體防御系統(tǒng)。而COPD患者的氣道解剖結(jié)構(gòu)及基本反射減弱或消失，患者肺組織病理切片上可以發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞的纖毛發(fā)生粘連、倒伏、脫失，氣管壁黏液腺及杯狀細(xì)胞增生，纖毛上皮破壞等［6］。防御系統(tǒng)的減弱，使上呼吸道定植的細(xì)菌移行而來，也可能由外界環(huán)境中的致病菌直接感染而成，這可能是細(xì)菌定植的病理基礎(chǔ)。我們的研究證實下呼吸道細(xì)菌定植存在動態(tài)變化，認(rèn)為是機體與細(xì)菌處于不同優(yōu)勢狀態(tài)的結(jié)果，也可能與細(xì)菌繁殖的周期有關(guān)。國外學(xué)者認(rèn)為，COPD穩(wěn)定期下呼吸道存在的細(xì)菌處于持續(xù)的周轉(zhuǎn)狀態(tài)，動態(tài)釋放出不同濃度的多種產(chǎn)物［7］。

本研究通過對誘導(dǎo)痰液中細(xì)胞因子的測定來了解下呼吸道的炎癥情況。TNF－α、IL－8、NE是近年來研究較多的細(xì)胞因子，反應(yīng)了氣道炎癥的程度［8］。而COPD的本質(zhì)是氣道的慢性非特異性炎癥，細(xì)胞因子的水平與氣道的炎癥程度相關(guān)。研究提示了LABC組較非LABC組痰中TNF－α、IL－8濃度增高，即LABC加重了氣道炎癥。有研究表明，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物使呼吸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，并因正反饋作用使炎癥效應(yīng)放大［9］。細(xì)菌破壞氣道上皮，干擾上皮來源的舒張因子的釋放，增加氣道周圍平滑肌的反應(yīng)性，同時氣道黏膜下腺由于受到細(xì)菌的侵襲分泌大量黏液。國外學(xué)者研究了咳痰與氣道炎癥，疾病進(jìn)展和細(xì)菌定植之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)咳痰組每天的IL－8水平、流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌的定植顯著高于無規(guī)律咳痰組［10］。這表明細(xì)菌定植與氣道炎癥存在相關(guān)性。氣道黏液增多及氣道平滑肌易于收縮，氣道阻力增加是肺功能水平低下的病理基礎(chǔ)。存在混合細(xì)菌感染，既往多次住院治療及口服激素的患者肺功能水平最差已得到證實［11］。但我們的研究隨訪時間短，LABC與肺功能的關(guān)系未取得陽性結(jié)果。

COPD病因及發(fā)病機制極為復(fù)雜，LABC是其中重要因素之一。Monso等［1］發(fā)現(xiàn)COPD患者穩(wěn)定期和急性發(fā)作期的主要致病菌相同。因此，LABC的研究對于COPD的治療和預(yù)防均有重要意義。

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