HER2基因RNA干擾質(zhì)粒對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖及凋亡的影響

韓 冬,徐 煌,李文浩,張成文

（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院,浙江 嘉興 314001）

HER2是一種腫瘤表面抗原,正常成年人的組織中不表達(dá)而在多種腫瘤組織中表達(dá)[1]。而且HER2的表達(dá)與腫瘤的惡性程度及腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。目前已有針對(duì)HER2蛋白的單克隆抗體藥物上市,用作HER2過表達(dá)的乳腺癌的治療手段,并展現(xiàn)出良好的臨床療效。人們意識(shí)到抑制HER2蛋白,可以抑制其下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,起到控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用,將成為理想的腫瘤治療策略[2]。由于RNAi技術(shù)在實(shí)現(xiàn)基因沉默的過程中簡(jiǎn)便易行,給人們操縱基因提供了強(qiáng)有力的工具,大大地提升了基因治療的可行性[3]。運(yùn)用 RNAi技術(shù),在既往的研究中我們構(gòu)建了三個(gè)針對(duì)HER2基因的 RNA干擾質(zhì)粒,通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和western blot方法篩選出了HER2基因沉默效率最高的干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2。在本研究中我們將進(jìn)一步研究干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2對(duì)乳腺癌細(xì)胞SKBR-3的HER2基因干擾的生物學(xué)效應(yīng),主要探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡是否存在影響,為進(jìn)一步研究乳腺癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3購自中科院上海細(xì)胞庫,RNAi干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2由本室構(gòu)建并保存,Lipofectamine2000購自invitrogen公司,RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自GIBCO公司,RNase購自TAKARA公司,MTT、胰酶、PBS購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染 人乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3在RPMI1640 37℃5%CO2條件下培養(yǎng),在細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染,實(shí)驗(yàn)分三組HER2-shRNA2組（轉(zhuǎn)染高效干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2）、RNAi陰性對(duì)照組（negative control,轉(zhuǎn)染不針對(duì)任何基因的干擾質(zhì)粒）、空白對(duì)照組（blank control,不采取任何措施,直接培養(yǎng)）。轉(zhuǎn)染使用Lipofectam ine2000,具體操作步驟按試劑說明書進(jìn)行。

1.2.2 繪制細(xì)胞增殖曲線 分別取生長(zhǎng)良好的HER2-shRNA2組、RNAi陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的三組細(xì)胞,用胰酶消化,用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為1.0×104/ml,均勻接種于63個(gè)培養(yǎng)瓶中;每隔24 h每組進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù),每次每組取三瓶細(xì)胞分別計(jì)數(shù)取平均值。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果以時(shí)間為橫坐標(biāo),以單位細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 MTT比色法測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3采用胰酶消化后,調(diào)整細(xì)胞的濃度為1×105/ml,接種于96孔板中,細(xì)胞分為三組,分別為HER2-shRNA2組、RNAi陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組,三組質(zhì)粒各0.2μg分別加Lipofectamine 500μl。各孔加入濃度為5 g/LMTT 20μl,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,吸去上清,每孔加入 DMSO 100 μl,緩慢震蕩10min。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔,分別測(cè)定24 h、48 h、72 h、96 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔的吸光度值（OD490）,按照公式細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組）×100%,計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞 分別收集各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞1×106個(gè),離心后用PBS懸浮細(xì)胞,1 000 rpm離心10min,再清洗兩遍去上清,用70%冷乙醇迅速固定,4℃放置12 h以上后用PBS洗2次,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml,用 RNase消化,加入1.5m l PI（5 mg/100 ml）對(duì)DNA進(jìn)行染色?；靹蚝笤诹魇郊?xì)胞儀分析,G1期峰之前出現(xiàn)的亞峰為凋亡細(xì)胞峰,結(jié)果以凋亡細(xì)胞的百分率表示。

1.2.5 western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞SK-BR-3中PCNA的表達(dá)量 將轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的HER2-shRNA 2組 、negative control、blank control組分別用 PBS 洗三次,用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白,取100μg上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳結(jié)束后,將膠上的蛋白用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,封閉過夜,依次加入PCNA單克隆抗體、β-actin抗體為一抗和辣根過氧化酶標(biāo)二抗,用DAB顯色,拍照。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染狀態(tài) HER2-shRNA2和Negative control組質(zhì)粒中含有的綠色熒光蛋白基因與干擾序列共表達(dá),可作為轉(zhuǎn)染成功的報(bào)告蛋白。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后觀察到HER2-shRNA2和Negative control組中可見綠色熒光蛋白的表達(dá),說明干擾質(zhì)粒已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)到細(xì)胞當(dāng)中。而空白對(duì)照組,由于不轉(zhuǎn)染含有表達(dá)GFP綠色熒光蛋白的質(zhì)粒,在熒光顯微鏡下沒有觀察到綠色熒光。見圖1。

圖1 培養(yǎng)48 h后各組細(xì)胞熒光顯微鏡下形態(tài)（×100）

2.2 計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞增殖曲線 HER2-shRNA2組細(xì)胞增殖速度明顯比RNAi陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的增殖速度慢,抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象出現(xiàn)的比較早。在培養(yǎng)的第3天出現(xiàn)了顯著差異（P＜0.05）。見圖2 、3。

2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 MTT結(jié)果顯示HER2-shRNA2組在490 nm處的吸光度顯著降低,而RNAi陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組吸光度沒有明顯改變,說明沉默HER2基因后在一定程度上抑制了SKBR-3細(xì)胞的增殖。由表1中可以看出HER2-shRNA2轉(zhuǎn)染后48 h、72 h、96 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為 16.53%、39.03%、65.47%。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 以空白對(duì)照組作為對(duì)照HER2-shRNA2組在72 h和96 h的凋亡率分別為10.29%,17.36%,HER2-shRNA2組在72h后出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡峰。而blank control組和negative control組相比無顯著性差異。見表2。

圖2 各組細(xì)胞增殖曲線

圖3 各組細(xì)胞增殖第96h細(xì)胞形態(tài)（×100）

表1 MTT法檢測(cè)HER2-shRNA2對(duì)SK-BR-3細(xì)胞增殖的抑制作用

表2 流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.5 western b lot檢測(cè)PCNA的表達(dá) 增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞增殖旺盛時(shí),細(xì)胞中的PCNA表達(dá)量會(huì)很高;而當(dāng)細(xì)胞增殖受到抑制的時(shí)候,PCNA的表達(dá)量也會(huì)相應(yīng)下降。western blot的結(jié)果可知HER2-shRNA 2干擾質(zhì)粒組的PCNA表達(dá)量下降,表明干擾質(zhì)粒抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。見圖4。

3 討論

圖4 western blot檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組PCNA的表達(dá)

原癌基因HER2其編碼產(chǎn)物是具有受體酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白,屬于表皮生長(zhǎng)因子受體家族的成員。HER2激活后會(huì)引起一系列細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡以及對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性[4,5]。HER2的過表達(dá)常常提示腫瘤的惡性度高及其預(yù)后不良[6]。目前已有針對(duì)HER2蛋白的單克隆抗體藥物上市,用作HER2過表達(dá)的乳腺癌的治療手段,并展現(xiàn)出良好的臨床療效[7,8]。人們意識(shí)到抑制HER2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用,將成為理想的腫瘤治療策略。我們?cè)O(shè)想如果能通過RNAi的方法降低HER2在乳腺癌中的表達(dá),將會(huì)控制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及其浸潤(rùn)速度,為乳腺癌的治療提供新方法。

根據(jù)RNAi技術(shù)特點(diǎn)[9],shRNA和siRNA相比,shRNA在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性大大提高。siRNA在體內(nèi)的半衰期只有數(shù)天,而shRNA的半衰期可以達(dá)到數(shù)周甚至數(shù)月。因此研究RNAi的長(zhǎng)期生物學(xué)效應(yīng),必須構(gòu)建可在體內(nèi)長(zhǎng)期發(fā)揮作用的干擾質(zhì)粒。我們?cè)诩韧难芯恐袠?gòu)建了三個(gè)針對(duì)HER2基因的RNA干擾質(zhì)粒,并通過實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和western blot方法篩選出了基因沉默效率最高的干擾質(zhì)粒HER2-shRNA2。前期的實(shí)驗(yàn)只是對(duì)shRNA干擾HER2基因的直接效果進(jìn)行測(cè)試,將HER2-shRNA2轉(zhuǎn)染入SKBR-3乳腺癌細(xì)胞中出現(xiàn)了HER2mRNA和HER2蛋白表達(dá)水平的下降。而HER2基因被抑制后,會(huì)產(chǎn)生一系列的生物學(xué)反應(yīng),其中對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響則是我們關(guān)心的焦點(diǎn)。

在本次實(shí)驗(yàn)中我們首先對(duì)細(xì)胞增殖速度進(jìn)行了定量測(cè)定,采用了直接計(jì)數(shù)法和MTT比色測(cè)定兩種方法。通過直接計(jì)數(shù)的方法,我們可以直觀的看到shRNA的細(xì)胞增殖速度明顯比陰性對(duì)照和空白對(duì)照組慢。而通過MTT比色測(cè)定法計(jì)算的生長(zhǎng)抑制率和直接計(jì)數(shù)法繪制生長(zhǎng)曲線的結(jié)果是一致的。進(jìn)一步的流式細(xì)胞儀檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染HER2-shRNA2干擾質(zhì)粒組的SK-BR-3細(xì)胞大多會(huì)停留在G0/G1期,我們知道停留在G0/G1期的細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步走向凋亡的途徑[10],所以最終檢測(cè)結(jié)果中HER2-shRNA2質(zhì)粒干擾組的細(xì)胞凋亡率大大提高。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是DNA聚合酶δ的輔助蛋白,它是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)。當(dāng)細(xì)胞增殖旺盛時(shí),細(xì)胞中的PCNA表達(dá)量會(huì)很;而當(dāng)細(xì)胞增殖受到抑制的時(shí)候,PCNA的表達(dá)量也會(huì)一定程度的下降。本實(shí)驗(yàn)對(duì)PCNA進(jìn)行了western blot檢測(cè),western blot的結(jié)果可知HER2-shRNA2干擾質(zhì)粒組的PCNA表達(dá)量下降,而在生長(zhǎng)旺盛的陰性對(duì)照和空白對(duì)照組的細(xì)胞中PCNA的表達(dá)大大增強(qiáng)。PCNA的測(cè)定結(jié)果解釋了,為什么干擾質(zhì)粒組的細(xì)胞生長(zhǎng)速度比較慢,而RNAi陰性對(duì)照和空白對(duì)照組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度較快。

HER2是一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的起始分子,它會(huì)發(fā)動(dòng)一系列的生物學(xué)反應(yīng)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示HER2-shRNA2干擾質(zhì)粒在細(xì)胞水平可以抑制HER2基因和HER2蛋白的表達(dá),并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡,最終控制乳腺癌細(xì)胞的增殖速度,可以做為活體動(dòng)物水平抗腫瘤實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選載體,有望開發(fā)為新一代抗腫瘤基因藥物。

[1]Subik K,Lee JF,Baxter L,et al.The Expression Patterns of ER,PP,HER2,CK5/6,EGFR,Ki-67 and AR by immunohistochem ical analysis in BreastCancer Cell Lines[J].BreastCancer,2010,20（4）:35.

[2]ScaltritiM,Baselga J.The epidermal growth factor receptor pathway:a model for targeted therapy[J].Clin Cancer Res,2006,12:5268.

[3]Dykxhoorn DM,Palliser D,Lieberman J.The silent treatment:siRNAsas smallmolecule drugs[J].Gene Ther,2006,13:541.

[4]Engelsen IB,Stefansson IM,Beroukhim R,et al.HER-2/neu expression is associated with high tumor cellproliferation and aggressive phenotype in a population based patient seriesofendometrialcarcinomas[J].Int JOncol,2008,32（2）:307.

[5]Mittendorf EA,Liu Y,Tucker SL,et al.A novel interaction between HER2/neu and cyclin E in breast cancer[J].Oncogene,2010,29（27）:3896.

[6]TsutsuiS,Ohno S,Murakami S,etal.Prognostic value of C-erbB2 expression in breast cancer[J].JSurg Oncol,2002,79（4）:216.

[7]Piccart-Gebhart MJ,Proctor M,Leyland-Jones B,Goldhirsch A,et al.Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer[J].N Engl JMed,2005,353:1659.

[8]ScheueW,Friess T,BurtscherH,et al.Strongly enhanced antitumor activity of trastuzumab and pertuzumab combination treatment on HER2-positive human xenograft tumormodel[J].Cancer Res,2009,69（24）:9330.

[9]Aigner A.Application of RNA interference:current state and prospects for siRNA-base strategies in vivo[J].JAppl Microbiol Biotechnol,2007,76（1）:9.

[10]Spidlen J,Shooshtari P,Kollmann TR,et al.Flow cytometry data standards[J].BMC Res Notes,2011,4（1）:50.