胃樂散對急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠肝臟的保護作用*

舒 濤,范振海,吳 芹,楊桂荷,余麗梅,兌丹華

急性梗阻性化膿性膽管炎（acute obstructive suppurative cholangitis,AOSC）是膽管感染中一種嚴重的疾病,具有發(fā)病急驟、病情兇險、變化快速、并發(fā)癥多、病死率高等特點。盡管近年來在外科手術治療的基礎上,綜合采取抗生素治療、重癥監(jiān)護和營養(yǎng)支持等手段大大提高了該病的治療效果,但仍有較高的病死率[1-2]。

AOSC基本發(fā)病因素為膽管梗阻和細菌感染,除引起膽管梗阻、膽汁淤積外,且有其他系統(tǒng)和器官的損害,病變發(fā)展至后期常伴休克和多器官功能衰竭。肝損害被認為是其中較突出的一種表現。應充分認識膽石病導致肝臟損害的危害性,及早采取外科手術解除膽管梗阻,并控制感染,減低患者的肝臟損害,可顯著改善患者的預后和降低病死率[3-4]。

胃樂散（wei-le-san,WLS）在貴州省黔東南地區(qū)民間用于胃炎、膽絞痛、腹瀉的治療,治療胃脘痛效果良好。實驗研究表明,WLS對消化性潰瘍具有較好的治療作用,并可調節(jié)胃腸運動功能[5-6]。

本研究旨在觀察WLS對AOSC治療作用、減低血清膽紅素水平、減輕膽管損傷的同時,進一步觀察WLS對AOSC模型大鼠肝臟損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級Wistar大鼠32只,由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供,合格證書號為SCXK2002008。

1.1.2 試劑與藥品 WLS主要由白芍、蒼術、元胡、肉桂等中藥組成,藥材購于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院中藥房,由遵義醫(yī)學院藥理教研室根據民間驗方制成散劑,用時將WLS用蒸餾水配成2%和4%的混懸液,4℃儲存?zhèn)溆?。大腸桿菌Fischerichin菌株25922由微生物學教研室張德剛老師饋贈。大腸桿菌培養(yǎng)液（蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、伊紅美艷瓊脂20g、量筒量取牛肉膏1000mL；將蛋白胨10g、氯化鈉5g、牛肉浸膏溶液,于pH值7.6～7.8范圍之間滅菌、分裝、儲存?zhèn)溆茫?.1.3 主要儀器設備 TDGC2J-0.5超凈工作臺（上海先鋒電器廠）、SHA-C控溫水浴振蕩器（深圳天南海北實業(yè)有限公司）、全自動生化分析儀（日本Olympus,Au2700型）、電子分析天平（德國Sartarius）等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組 雄性大鼠32只,體質量（250± 20）g,適應性喂養(yǎng)1周后,將大鼠隨機分成4組,分別為假手術組、模型組、WLS低劑量組（0.2g/kg）、WLS高劑量組（0.4g/kg）,每組8只,分籠喂養(yǎng)。

1.2.2 細菌溶液的制備 大腸桿菌轉種于瓊脂蛋白胨斜面培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)24h后。無菌生理鹽水洗滌,離心沉淀后加適量生理鹽水,用Brown氏細菌數量比濁管比濁配成稀釋液,含菌量為1.0×109cfu/mL。

1.2.3 AOSC大鼠模型制備 制模前禁食12h,但不禁水,以10%水合氯醛腹腔麻醉（0.35mL/100g）,仰臥位固定,參照文獻[4-7]的方法,分離膽總管,經膽管插管向膽總管內注入大腸桿菌O25922稀釋液0.2mL后,不完全結扎膽總管制備AOSC大鼠模型。假手術組分離膽總管,但不注射大腸桿菌,也不結扎膽總管,分層縫合腹腔、腹壁。術后當天,各組分別灌胃給予生理鹽水及相應藥物,每天2次。

1.2.4 血液生化檢測 術后72h后,予水合氯醛麻醉大鼠,頸總動脈取血1.5mL,注入EDTA-K2抗凝管中,送遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科檢測反應肝功能指標的亮氨酸氨基轉移酶（aminoleucine transferase,ALT）,天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase,AST）和總膽紅素（total bilirubin,TBIL）。

1.2.5 膽管和肝臟病理學檢查 術后72h后,頸動脈放血處死大鼠,肉眼檢查膽管和肝臟的大體病理學變化,并取肝組織置于10%的中性甲醛中固定過夜,常規(guī)石蠟包埋,切片,乙醇梯度脫水,HE染色,二甲苯透明,中性樹膠封片,于光鏡下觀察肝臟組織結構的病理變化。

1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數據按完全隨機對照設計的要求收集整理,所有數據以±s表示,全部數據采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行ONE-WAY ANOVA處理,兩組間均數比較用t檢驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 WLS對AOSC模型大鼠肝功能的影響 與假手術組相比,模型組及各給藥組血清中反應肝功能的重要指標ALT和AST水平顯著升高（P＜0.01）；經WLS治療72h后,與模型組比較,WLS低劑量組血清中ALT、AST水平明顯降低（P＜0.05）,高劑量組有下降的趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,見表1。

表1 WLS對急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血ALT和AST水平的影響±s,n=8）

表1 WLS對急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血ALT和AST水平的影響±s,n=8）

*：P＜0.05,**：P＜0.01,與模型組比較；#：P＜0.01,與假手術組比較。

組別 ALT（U/L） AST（U/L）假手術組 42.88±17.47** 118.38±29.99**模型組 1113.75±569.15 2569.12±703.85WLS低劑量組 593.00±72.73*# 1558.62±349.53*#WLS高劑量組 626.25±339.27# 2119.75±418.79#

2.2 WLS對AOSC模型大鼠TBIL水平的影響 與假手術組相比,模型組和WLS高、低劑量組TBIL水平顯著升高（P＜0.01）；WLS低劑量組治療72h后,與模型組相比,TBIL水平顯著降低（P＜0.01）,而WLS高劑量組TBIL水平卻無顯著變化（P＞0.05）,見表2。

表2 WLS對急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血TBIL水平的影響（±s,n=8）

表2 WLS對急性化膿性梗阻性膽管炎大鼠血TBIL水平的影響（±s,n=8）

*：P＜0.01,與模型組比較；#：P＜0.01,與假手術組比較。

組別 TBIL（μ mol/L）假手術組 1.35±0.65*模型組 155.62±17.10WLS低劑量組 112.32±17.38*#WLS高劑量組 148.26±36.20#

2.3 WLS對AOSC模型大鼠肝臟組織形態(tài)學改變的影響模型組大鼠制模后72h剖腹,肉眼可見膽總管擴張,肝臟腫大淤血,顆粒增粗,肝臟表面有較多散在膿苔；光鏡下觀察可見膽總管上皮的明顯破壞和組織水腫,肝細胞出現不同程度的空泡變性和壞死,有的融合成片,匯管區(qū)大量炎細胞浸潤,中央靜脈及肝竇充血；膽小管擴張、淤膽。而假手術組大鼠膽總管和肝臟肉眼未見明顯異常,鏡下見肝小葉結構正常,肝細胞排列呈索狀,無壞死及變性,肝竇無擴張,血管及膽管結構正常。WLS高、低劑量組大鼠肝臟腫大程度減輕,肝臟表面膿苔減少,肝組織結構保持較好,點、片狀肝細胞變性、壞死明顯減少,炎細胞浸潤也減少（封3圖1）。

3 討論

膽石病對肝臟的損害主要發(fā)生在原發(fā)性膽管結石病,這些損害及其并發(fā)癥常構成復雜的肝外科問題。AOSC患者死亡尸解肝膿腫發(fā)生率可高達80%以上,持久的膽管梗阻可造成阻塞膽管范圍的肝內膽汁淤積,肝實質細胞破壞,膽汁性肝硬化和肝葉、肝段的纖維化、A LT升高等[8]。臨床和動物實驗研究均已報道,隨著急性膽管炎病程的發(fā)展,肝損害也隨時間延長而加重,可形成肝膿腫,直接與血行途徑,以及血行與直接途徑相互影響,引起肝細胞損傷,降低肝功能,引起膽紅素沉積,導致肝功能衰竭等[9-10]。

本實驗采用膽管插管注入大腸桿菌的方法并結扎大鼠膽管建立急性化膿性膽管炎實驗模型。制模72h后,模型組大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平均顯著高于假手術組,光鏡下見膽總管擴張,肝、膽組織出現大量片狀壞死等顯著病理變化,證明在AOSC模型成功建立的基礎上,由于膽管的阻塞,產生了明顯的肝損害,并導致了肝功能的明顯降低。值得注意的是,盡管WLS高、低劑量組之間,反應肝功能變化的大鼠血清ALT、AST水平無顯著差異,但 WLS低劑量組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平較模型組均顯著降低。且肝臟的組織病理學檢查進一步證實,WLS高、低劑量組大鼠肝臟腫大程度減輕,肝臟表面膿苔減少,肝小葉結構保持較好,肝細胞壞死明顯減少,以WLS低劑量組改善更為明顯,表明WLS對AOSC引起的肝損傷具有明顯的保護作用。提示在AOSC外科解除膽管梗阻治療前后,合理配合中藥治療[10-11],在減輕膽管損傷、保護肝臟等方面WLS可能具有良好的應用前景。

文獻報道WLS組方中蒼術所含的蒼術揮發(fā)油具有利尿、抗炎癥、鎮(zhèn)痛等作用；蒼術具有保肝,并對大腸桿菌等有較好的殺滅作用[12-13]。肉桂對大腸桿菌、痢疾桿菌等有明顯抑制作用,并可促進血液循環(huán)、發(fā)揮抗炎作用等。白芍及其有效成分具有抗炎、保肝、免疫調節(jié)等作用[14-15],這些可能是WLS發(fā)揮其減輕AOSC引起肝損傷作用的基礎。至于高劑量組效果不如低劑量組,可能由于隨著劑量增加WLS增高上述指標的活性成分開始發(fā)揮作用,但其確切機制有待深入研究。

[1]張元,曹邦清,曾宏,等.膽囊切除術后非損傷性黃疸的原因及處理[J].臨床外科雜志,2003,11（4）：262-263.

[2]曹盛世.膽石病導致肝臟損害的處理[J].實用臨床醫(yī)學，2002,3（5）：35-36.

[3]陸融,崔乃強,梅建勛.急性重癥膽管炎模型大鼠肝臟細胞凋亡和壞死的比較研究[J].中國中西醫(yī)結合外科雜志,2000,6（3）：155-157.

[4]寇麗,薛承銳,齊清會,等.大鼠急性不全梗阻性膽管炎模型的建立[J].中國中西醫(yī)結合外科雜志,2005,11（2）： 138-140.

[5]余麗梅,鄧江,孫安盛,等.胃樂散對實驗性胃潰瘍的作用[J].遵義醫(yī)學院學報,2001,24（5）：388-390.

[6]羅勇,文國容,余麗梅,等.胃樂散對小鼠腸運動功能影響的實驗研究[J].貴州醫(yī)藥,2004,28（2）：120-121.

[7]袁濤,劉宏鳴,賴曉東,等.TNF-α在急性膽管炎大鼠血漿和膽汁中的變化[J].重慶醫(yī)學,2009,38（20）：2601-2602.

[8]鐘大昌,冉瑞圖.關于急性梗阻性化膿性膽管炎的幾個問題[J].普外臨床,1986,1：214.

[9]黃鶴光,殷風峙,石錚.重癥急性膽管炎伴肝腎功能不全時的肝腎病理改變[J].中華實驗外科雜志,1996,13（5）： 298-299.

[10]王志偉,吳印愛,劉獻棠,等.丹參對急性梗阻性化膿性膽管炎患者術后肝功能的影響[J].2003,31（4）：88,90.

[11]趙承梅,劉檔梁,宋博毅, .

[J]. ,2002,21（1）：30-31.

[12] , . [J]. ,2006,35（3）：75.

[13]. [J]. ,2009,24（1）： 181-182.

[14] , , , .

[J]. ,2009,26（2）：151-153.

[15], . [J]. ,2008,30（4）：538-541.