基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在急性心肌梗死中的應(yīng)用前景

瞿海龍,麻曉靜,張 冰,梁 璐

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞,能夠向中胚層起源的各類細(xì)胞分化,目前已用于急性心肌梗死的臨床研究。然而MSCs在體內(nèi)存活時(shí)間短,其臨床療效有待于進(jìn)一步提高?，F(xiàn)就基因修飾后間充質(zhì)干細(xì)胞在急性心肌梗死中的應(yīng)用綜述如下。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞的特性

MSCs在特定微環(huán)境和適宜的細(xì)胞因子作用下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和心肌細(xì)胞等[1]。此類細(xì)胞可從骨髓、臍帶血及脂肪組織中提取。由于MSCs具有多向分化和體外自我增殖特性,使其成為再生醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。體外研究表明MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能,能夠抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和抗原呈遞細(xì)胞的成熟,同時(shí)可調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能,抑制炎癥介質(zhì)的釋放[2]。MSCs在體內(nèi)可使宿主的巨噬細(xì)胞發(fā)生基因重組,調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng),促進(jìn)白介素-10的表達(dá),減少敗血癥的發(fā)生[3]。

由于MSCs的再生特性和免疫調(diào)節(jié)作用,使其在治療退行性疾病、炎癥疾病、免疫系統(tǒng)疾病具有明顯優(yōu)勢(shì)。然而從目前臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,盡管MSCs移植安全性高,但其療效不容樂(lè)觀,更多學(xué)者已將M SCs進(jìn)行基因修飾后用于實(shí)驗(yàn)研究,以便取得更好的臨床療效。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞的提取與表型特征

MSCs可從各類組織中獲取,其中以骨髓MSCs研究最為深入。目前,用于分離骨髓MSCs的方法主要有兩種:貼壁篩選法和密度梯度分離法。貼壁篩選法根據(jù)MSCs可黏附在培養(yǎng)瓶上貼壁生長(zhǎng)的特性,將抽取的骨髓細(xì)胞直接貼壁培養(yǎng),經(jīng)多次換液后去掉未貼壁細(xì)胞。該方法分離后所得的MSCs純度不高。最常用的是密度梯度分離法。從動(dòng)物骨髓中抽取骨髓,利用分離液對(duì)其離心,收集位于分離液和懸浮液界面的單個(gè)核細(xì)胞層培養(yǎng),通過(guò)換液和傳代純化MSCs。

MSCs在無(wú)誘導(dǎo)物的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)成紡綞狀成纖維細(xì)胞樣,表達(dá) SH2、SH3、CD29、CD44、CD27、CD90、CD105、CD106、CD166、CD120a、CD124,而缺乏造血干細(xì)胞表面的 CD34和白細(xì)胞表面的CD45標(biāo)志[4]。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞的基因修飾

目前用于動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)的基因治療多以病毒作為轉(zhuǎn)染載體。盡管病毒載體對(duì)不同種細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率存在很大差異,但由于其趨向性和侵染性高,仍是應(yīng)用最為普遍的載體。在人體基因治療實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的基因載體為腺病毒(adenoviruses Ad)、反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses RV)、慢病毒。M cM ahon等[5]研究表明,不同組織來(lái)源的MSCs能夠被Ad、Rv有效轉(zhuǎn)染。Rv載體可整合到MSCs的DNA中,促進(jìn)治療基因的持續(xù)表達(dá)。然而有報(bào)道顯示Rv轉(zhuǎn)染造血干細(xì)胞后造成插入誘變,使其臨床應(yīng)用的安全性受到質(zhì)疑[6]。Ad載體雖不能整合到宿主細(xì)胞的DNA內(nèi),但在注入動(dòng)物及人體后可產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng),且由于Ad載體不能有效整合,只能促進(jìn)增殖期干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因短暫表達(dá)。最近Stender等[7]利用腺相關(guān)病毒(adeno-associated viruses AAV)低免疫原性的特點(diǎn),以其為載體,成功轉(zhuǎn)染MSCs,使其成為另一種可供選擇的病毒載體。

除病毒載體外,非病毒載體的研究與開(kāi)發(fā)也成為基因治療的熱點(diǎn)。與病毒載體不同,非病毒載體具有設(shè)計(jì)靈活、低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制備、可批量生產(chǎn)等特點(diǎn)。目前用于MSCs轉(zhuǎn)染的非病毒載體有脂質(zhì)體DNA復(fù)合物、多聚物載體、電穿孔、核轉(zhuǎn)染等。Hoare等[8]利用脂質(zhì)體修飾的核定位系列多肽轉(zhuǎn)染MSCs發(fā)現(xiàn),非病毒載體是一種有效可行的方法,可加強(qiáng)MSCs治療效應(yīng)。然而非病毒載體的研究尚處于起始階段,還存在著較多未解決的問(wèn)題,例如,如何克服核膜障礙、如何降低血清成分干擾、長(zhǎng)期應(yīng)用是否存在安全性問(wèn)題、如何提高通過(guò)受體獲取靶向性的成功率等。因此,非病毒載體仍有待于隨著基礎(chǔ)科學(xué)的進(jìn)一步研究而得到不斷地發(fā)展。

4 基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞在動(dòng)物急性心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究

在過(guò)去的幾年中,隨著對(duì)基因修飾MSCs研究的不斷深入,使其在治療癌癥、神經(jīng)損傷修復(fù)、骨和軟骨再生、急性心血管疾患方面取得顯著實(shí)驗(yàn)成果。

Mangi等[9]認(rèn)為促進(jìn)MSCs抗凋亡信號(hào)蛋白 Akt的表達(dá),能夠提高梗死心肌的修復(fù)。在其隨后的實(shí)驗(yàn)中,將反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的MSCs移植到梗死大鼠的心肌內(nèi),使其過(guò)渡表達(dá)促存活基因Akt,結(jié)果與對(duì)照組比較,可明顯減少梗死心肌面積,抑制心室重構(gòu),提高左室射血功能。最初認(rèn)為MSCs移植取得的治療效益是由于其在體內(nèi)分化為心肌細(xì)胞,而隨后的研究顯示其作用主要得益于促進(jìn)抗炎癥因子、促修復(fù)因子的表達(dá)[10]。

Li等[11]采用非病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs,促進(jìn)另一種存活蛋白Bcl-2的表達(dá),可以延長(zhǎng)M SCs在梗死心肌內(nèi)的存活時(shí)間,減少梗死心肌面積,提高左室功能。最近一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)顯示,應(yīng)用腺病毒對(duì)MSCs進(jìn)行血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和干細(xì)胞歸巢因子SDF-1雙重修飾,在大鼠梗死后7 d移植到心肌內(nèi),這些移植細(xì)胞呈現(xiàn)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表型特征,在移植后4周可明顯提高梗死區(qū)血管密度,抑制心肌纖維化,提高左室功能[12]。

基因修飾MSCs在治療急性心肌梗死具有以下特點(diǎn):①與非轉(zhuǎn)染MSCs相比,基因修飾MSCs可促進(jìn)蛋白表達(dá),提高其在梗死心肌內(nèi)的停留與存活,促進(jìn)抗炎因子和促血管形成因子的產(chǎn)生。②對(duì)MSCs進(jìn)行2種或2種以上作用機(jī)制互補(bǔ)基因轉(zhuǎn)染(如促存活基因和促血管形成基因)是安全可行的,而且將會(huì)成為提高干細(xì)胞療效的首選方法;③從大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果來(lái)看,目前用于基因轉(zhuǎn)染的病毒載體和非病毒載體在人體內(nèi)應(yīng)用,應(yīng)該是安全有效的;④對(duì)于基因修飾MSCs治療動(dòng)脈粥樣硬化和急性心肌梗死的療效,多源于大鼠的實(shí)驗(yàn)研究,其在大的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中作用需進(jìn)一步完善和證實(shí);⑤目前基因修飾MSCs移植途徑多采用直接心肌內(nèi)注射的方法,靜脈或冠脈途徑移植卻很少采用,而后兩種方法在臨床研究中更具有實(shí)用性,因此動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需完善相關(guān)研究。

5 基因修飾MSCs在臨床中的應(yīng)用前景

盡管基因轉(zhuǎn)染MSCs在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中取得顯著療效,但目前尚未進(jìn)入臨床階段。載體系統(tǒng)在人體內(nèi)的有效性和安全性是首要考慮的問(wèn)題。最近發(fā)展的第三代腺病毒載體,由于結(jié)構(gòu)中僅含有極少量殘存腺病毒DNA,可減少其在體內(nèi)引起的免疫反應(yīng),使其有望成為進(jìn)入人體的一代載體。能夠促使基因長(zhǎng)期表達(dá)的位點(diǎn)特異性重組載體,目前也正在研制之中?；蛐揎桵SCs治療急性心肌梗死要進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)需滿足以下幾點(diǎn):①需開(kāi)發(fā)一種安全、高效的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng),能夠促使基因持續(xù)且長(zhǎng)久表達(dá);②實(shí)現(xiàn)基因修飾 MSCs與生物支架的有效結(jié)合,為MSCs的體內(nèi)存活提供穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境;③實(shí)現(xiàn)M SCs的大規(guī)模無(wú)血清培養(yǎng),以保證臨床經(jīng)濟(jì)有效的應(yīng)用?？傊?隨著對(duì)基因修飾MSCs研究的深入,其有望成為不同于內(nèi)科傳統(tǒng)藥物治療、心血管介入治療和外科手術(shù)治療的又一全新治療方法。

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