r DNA-ITS序列鑒定深部真菌菌種的研究進(jìn)展

仇萌 鄒先彪

(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院皮膚科,北京 100048)

近年來,隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛躍發(fā)展,抗生素、免疫抑制劑、皮質(zhì)類固醇激素在臨床得以廣泛應(yīng)用,介入治療、器官移植、導(dǎo)管插管等技術(shù)普遍開展,又因免疫障礙和艾滋病的流行,深部真菌感染呈持續(xù)上升趨勢,且預(yù)后較差,病死率高。引起深部真菌感染的真菌種類很多,臨床常見的有念珠菌、隱球菌、曲霉菌、毛霉菌、青霉菌、孢子絲菌等。有報道,念珠菌屬的感染在獲得性血液感染中已經(jīng)占第 4位,是院內(nèi)真菌感染的 78.3%。近年來,曲霉菌感染已經(jīng)上升到了深部真菌感染的第 2位[1]。深部真菌感染的診斷一直是臨床微生物實驗室的主要難題,其早期診斷對深部真菌感染的臨床結(jié)果有著重大影響,在越來越多的耐藥菌株出現(xiàn)后,菌種鑒別的重要性已不容忽視。傳統(tǒng)的真菌分類方法主要根據(jù)真菌的形態(tài)學(xué)、生理生化特點及生理生化指標(biāo)來來進(jìn)行分析,但由于某些真菌屬、種之間的形態(tài)學(xué)或生理生化差異極不顯著,且真菌的培養(yǎng)和檢出需要特殊培養(yǎng)條件和方法以及多數(shù)真菌的生長緩慢等特點的影響,給真菌鑒定工作帶來困難。隨著 1953年 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出,分子生物學(xué)檢測手段被發(fā)現(xiàn)在真菌快速檢測和鑒定方面有巨大的潛能,包括多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reactions,PCR)、限制性片段長度多態(tài)性分析 (restriction fragment length polymorphism,RFLP)、分子雜交及隨機擴增多態(tài)性分析 DNA(random amplification of polymorphic DNA,RADP)等[2]。目前,這些分子生物學(xué)檢測方法多聚焦于對 rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (internal transcribed spacer,ITS)序列分析的研究,主要是由于該區(qū)域可從不太長的核酸序列中獲得相對足夠的信息用來研究深部真菌種間及部分種內(nèi)群體的關(guān)系[3]。本文對真菌基因組rDNA的 ITS序列在深部真菌鑒定方面的研究現(xiàn)狀作一簡要概述。

1 r DNA-ITS的結(jié)構(gòu)及其特點

構(gòu)成真核生物核糖體的 rRNA由 rDNA編碼,rDNA是基因組 DNA中的中等重復(fù)、串聯(lián)排列、并有轉(zhuǎn)錄活性的基因家族[4]。rDNA一般由轉(zhuǎn)錄區(qū)和非轉(zhuǎn)錄區(qū)構(gòu)成。轉(zhuǎn)錄區(qū)包括 5S、5.8S、18S和 28S rDNA,其中 18S、5.8S和 28S rDNA基因組成一個轉(zhuǎn)錄單元,產(chǎn)生一個前體 RNA。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1(internal transcribed spacer1)位于 18S和 5.8S rDNA之間,內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ITS2位于 5.8S和 28S rDNA之間,ITS1和 ITS2合稱為 ITS。在染色體上ITS可被轉(zhuǎn)錄,分開這些重復(fù)序列的 DNA片段稱為非轉(zhuǎn)錄區(qū) (nontranscribed spacers,NTS),在 18SrDNA基因上游和 28SrDNA基因下游的小片段稱外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ETS(external transcribed space),NTS和 ETS一起組成基因間隔區(qū) (internal gene spacers,IGS),在轉(zhuǎn)錄時有啟動和識別作用[5,6]。ITS和ETS包含有 rDNA前體加工的信息,在 rRNA成熟過程中有著相當(dāng)重要的作用。真菌 rDNA基因組內(nèi)有 60～200個拷貝,其中 ITS區(qū)域長度一般在650～750 bp之間。

2 rDNA-ITS序列分析的應(yīng)用原理

rDNA上的 18S、5.8S、28SrDNA基因序列進(jìn)化速率慢且相對保守,存在廣泛的異種同源性,其中小亞基 18SrDNA序列常被用來研究屬及屬以上分類群的演化關(guān)系,大亞基 28S rDNA中的 D1/D2區(qū)域可用于屬及臨近等級的分類群[7]。rDNA-ITS由于不加入成熟核糖體,所以受到的選擇壓力較小,進(jìn)化速率較快,具有廣泛的序列多態(tài)性,在其保守性上表現(xiàn)為在種內(nèi)不同菌株之間高度保守,而在真菌種間差異明顯,這種特點使得 ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[8]。ITS區(qū)域相對較短,能夠很容易根據(jù)其保守區(qū)設(shè)計通用引物,進(jìn)行 PCR擴增,且該序列具有重復(fù)的多拷貝特性,使 ITS區(qū)很容易從少量、稀疏或高度降解的 DNA樣品中獲得[9]。

3 ITS序列分析的方法學(xué)

真菌 rDNA-ITS序列分析用于深部真菌的診斷和鑒定多通過 PCR技術(shù)實現(xiàn)。其序列分析方法一般主要有兩種方法,即 rDNA序列測定分析法和 RFLP分析法[10]。其中引物設(shè)計是 PCR擴增過程的重要步驟,若確定真菌感染,則引物設(shè)計依據(jù)真菌的保守序列,一般針對核糖體蛋白基因(rDNA)及其內(nèi)部 ITS,常用引物有 ITS1、ITS1-F、ITS2、ITS3、ITS4、ITS4-B等;若鑒定感染真菌的種類則應(yīng)根據(jù)屬種間高變區(qū)或特異基因設(shè)計特異性引物,直接鑒定至種或群[11]。在研究過程中,在引物引導(dǎo)下,以真菌的核酸為模板,擴增出包括ITS1、5.8S和 ITS2的全長 ITS區(qū)域序列,結(jié)合DNA序列測定分析和 RFLP分析,進(jìn)而對真菌進(jìn)行分類鑒定。

4 ITS序列分析在深部真菌分類鑒定中的應(yīng)用

由于 rDNA-ITS序列能準(zhǔn)確快速地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異,目前已越來越廣泛地應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。其中研究最多的是念珠菌屬和曲霉屬。Bobby等[12]使用焦磷酸測序技術(shù) (pyrosequencing strategy)對 60株念珠菌屬菌株進(jìn)行 ITS2序列擴增后進(jìn)行菌種鑒定,結(jié)果 C.albicans,C.dubliniensis,C.glabrata,C.guilliermondii,C.krusei,C.lusitaniae,C.parapsilosis,and C.tropicalis均被正確檢測出,結(jié)果與生化檢測和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致,且檢測時間 (6 h)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于生化檢測 (26 h)和形態(tài)學(xué)鑒定 (82 h)所需時間。Adam等[13]使用核糖體 ITS區(qū)及大亞基 D1/D2區(qū)測序法從 1位真菌性腹膜炎患者的腹水中分離出Candida subhashii。Yong等[14]報道曾在兩名白血病患者血液中分離出一種罕見念珠菌菌株,經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)和生化試驗鑒定為 C.parapsilosis,而通過真菌特異性寡核苷酸引物 ITS1和 ITS4對該菌株進(jìn)行 PCR擴增,并將 PCR產(chǎn)物純化及使用 BLAST和CLUSTAL序列分析軟件進(jìn)行序列測定,最終鑒定結(jié)果為 Candida orthopsilosis(為 C.parapsilosis的一個亞種,在形態(tài)上與 C.parapsilosis難以鑒別)。Aspergillus flavus,A.fumigatus,and A.terreus是侵襲性曲霉病的 3種主要致病菌,其侵襲力、病死率及對抗真菌藥物的敏感性差異較大,從種的水平上進(jìn)行鑒別尤為困難。Henry等[15]應(yīng)用 ITS1和 ITS4兩種引物對 11份臨床標(biāo)本進(jìn)行了雙盲試驗,對曲霉的這 3種致病菌種進(jìn)行了鑒定,PCR方法與形態(tài)學(xué)方法取得了較好的一致性。美國學(xué)者 Hans等[16]分別使用核糖體大亞基 D1-D2區(qū)、ITS1區(qū)、ITS2區(qū)對曲霉菌屬的 Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavipes、Aspergillus flavus等 13個菌種進(jìn)行鑒定,使用 DNA序列比對及雙核苷酸比對法后顯示 D1-D2區(qū)序列種間序列差異為 91.9%～99.6%,ITS1區(qū)種間序列差異為 57.4%～98.1%,ITS2區(qū)為 75.6%～98.3%。使用 GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析顯示對于親緣關(guān)系較近但不同的菌種,13個菌種中有 10個菌種在 D1-D2區(qū)上表現(xiàn)出小于 1的核苷酸歧異度,而僅有 5個菌種在 ITS1或 ITS2區(qū)表現(xiàn)出小于 1的核苷酸歧異度,由此可見,ITS區(qū)在種水平上有更強的鑒別力。ITS區(qū)除了廣泛應(yīng)用于念珠菌屬及曲霉菌屬種的水平上鑒定以外,近年來,也有不少學(xué)者逐漸將其用于隱球菌屬、孢子絲菌屬的種間及菌株間鑒定。Masakazu等[17]聯(lián)合使用 PCR指紋技術(shù)及 RAPD技術(shù)對來自于日本和澳大利亞的 96株新生隱球菌菌株的 ITS區(qū)進(jìn)行序列分析,并明確地將新生隱球菌鑒定至變種水平。Watanabe等[18]曾對 12個國家的臨床標(biāo)本中分離的 204株申克孢子絲菌的 ITS1、5.8SRNA基因和ITS2區(qū)測序分析,發(fā)現(xiàn)在各株之間堿基對差異一般是 8個以內(nèi),最大差異率是 3.2%,而在申克孢子絲菌和 Ceratocysis stenoceras之間堿基對的差異率是 10%以上。

在國內(nèi)的研究中,ITS序列在深部真菌的鑒定方面也取得了很大的進(jìn)展。王英等[19]應(yīng)用兩對ITS1、ITS4和 ITS86、ITS4通用引物對 7種 (8株)念珠菌進(jìn)行 PCR擴增,結(jié)果為 3.5 h內(nèi)對 7種念珠菌的菌懸液擴增出種特異的 DNA條帶,證明 ITS序列可以快速準(zhǔn)確地應(yīng)用于念珠菌屬種間鑒定。駱志成等[20]在國內(nèi)首次對煙曲霉 rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)進(jìn)行克隆測序分析,結(jié)果顯示,煙曲霉rRNA基因的 ITS1、ITS2區(qū)均十分保守。與黃曲霉、黑曲霉、土曲霉等比較,均有一定程度的差異,這說明其種間 ITS區(qū)序列變異大于種內(nèi)變異。竇紅濤等[21]將受試鐮刀菌接種于 PDA培養(yǎng)基,觀察其菌落及鏡下形態(tài),在此基礎(chǔ)上 PCR擴增受試鐮刀菌的 rDNA ITS并測其序列,在 GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源序列搜索及分析。形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果顯示,茄病鐮刀菌所占比例最高,除 2株串珠鐮刀菌外,其余鐮刀菌 ITS序列分析的結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。茄病、層生和串珠鐮刀菌的 Dra II、Cfr13 I酶切帶形互不相同。用 Sol1、Sol2擴增受試菌的 rDNA ITS,只有茄病鐮刀菌為陽性。提示 rDNA ITS序列測定及其 PCR-RFLP可用于初步鑒別幾種臨床常見鐮刀菌,合適的種特異性引物可以初步快速鑒定茄病鐮刀菌。王永晨等[22]從疑似申克孢子絲菌感染患者的感染部位表面刮取物、腐爛組織或活檢組織中提取 DNA,并應(yīng)用合成的申克孢子絲菌特異性引物 1TS3-SSP進(jìn)行核糖體DNA內(nèi) ITS2靶序列 PCR擴增,結(jié)果示在 17例經(jīng)形態(tài)學(xué)檢查和真菌培養(yǎng)檢查證實的組織標(biāo)本中,有12例擴增出 191 bp的片段,其中 7例組織中發(fā)現(xiàn)染成紫紅色的圓形或卵圓形的孢子。陳敏等[23]采用真菌通用引物 ITS1、ITS4對 12株新生隱球菌不同變種標(biāo)準(zhǔn)株的 ITS片段進(jìn)行 PCR擴增和測序,結(jié)合基因庫等數(shù)據(jù)庫中 11株新生隱球菌標(biāo)準(zhǔn)株的ITS序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)新生隱球菌變種之間 ITS序列存在明顯差異,存在 6種亞型;格特隱球菌 ITS序列存在 4種亞型。中國發(fā)現(xiàn)的原新生隱球菌上海變種 s8012與格特隱球菌在表型及分子生物學(xué)研究均存在顯著的差異,但仍屬于變種內(nèi)差異。最終將我國發(fā)現(xiàn)的上海變種 s8012歸入格特隱球菌的 ITSC型,原格特隱球菌 RV20186歸入格特隱球菌的 ITSF型。

5 r DNA-ITS序列分析法鑒定深部真菌的應(yīng)用前景與展望

深部真菌的診斷對于患者的治療和預(yù)后起著決定性作用。rDNA-ITS序列分析法不僅豐富了真菌核糖體基因 ITS的序列信息,為真菌的分類鑒定及系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了十分重要的依據(jù),而且為建立病原菌的分子檢測與疾病的快速診斷技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

rDNA-ITS序列分析與傳統(tǒng)的真菌形態(tài)學(xué)鑒定方法相比較,受主觀經(jīng)驗與實驗條件的影響較小,而且快速簡便。但 ITS區(qū)域也不是能對所有真菌的屬種或組群進(jìn)行鑒別,分析結(jié)果可能會受到比對使用的基因庫完善程度的影響。因此,在基因庫中存在的、與待檢真菌親緣關(guān)系相近的已知真菌序列缺乏時 ITS序列分析的應(yīng)用能力就受到一定的限制。另外,有的真菌由于進(jìn)化順序、變異,甚至分析方法等原因,在間隔區(qū)上表現(xiàn)的差異性較小,不適合于屬內(nèi)種及種群的標(biāo)記;而且真菌的不同地理、不同寄生宿主型別的鑒定上也存在困難。以鐮刀菌為例,ITS序列對鐮刀菌種間水平上的分子鑒定是可行的,但鐮刀菌種內(nèi)群體水平在該區(qū)域上遺傳變異并不明顯,可能沒有差異或差異非常微小,使得 ITS區(qū)不適宜于鐮刀菌?；突蛏硇》N間的分類研究。近年來,隨著一些全新的 DNA測序方法,如雜交法、質(zhì)譜法、原子探針法、流動式單分子熒光檢測法、超薄水平凝膠電泳技術(shù)等逐漸應(yīng)用到 ITS序列分析中以及生物信息學(xué)的不斷完善[24],相信 rDNA-ITS列分析的應(yīng)用將會有更大的發(fā)展空間。

[1] Enoch DA,Ludlam HA,Brown NM.Invasive fungal infections:a review of epidemiology and management options[J].J Med Microbiol,2006,55(7):809-818.

[2] White PL,Archer AE,Barnes RA.Comparison of non-culturebased methods for detection of systemic fungal infections,with an emphasis on invasive Candida infections[J].J Clin Microbiol,2005,43(5):2181-2187.

[3] Schwarz P,Bretagne S,Gantier JC,et al.Molecular identification of zygomycetes from culture and experimentally infected tissues[J].J Clin Microbiol,2006,44(2):340-349.

[4] Manish K,Shukla PK.Use of PCR targeting of internal transcribed spacer regions an single-stranded conformation polymorphism analysis of sequence variation in different regions of r RNA genes in fungi for rapid diagnosis of mycotic keratitis[J].J Clin Microbiol,2005,43(2):662-668.

[5] Bellemain E,Carlsen T,Brochmann C,et al.ITS as an environmental DNA barcode for fungi:an in silico approach reveals potential PCR biases[J].BMC Microbiol,2010,10(5):189.

[6] Daniele C,Arianna T,Federica G,et al.DNA microarray based on arrayed-primer extension technique for identification of pathogenic fungiresponsible for invasive and superficial mycoses[J].J Clin Microbiol,2008,46(3):909-915.

[7] Makino H,Fujimoto J,Watanabe K.Development and evaluation of a real-time quantitative PCR assay for detection and enumeration of yeasts of public health interest in dairy products[J].Int JFood Microbiol,2010,140(1):76-83.

[8] Francesca T,Elena F,Paola P,et al.Exploring the diversity of the bifidobacterial population in the human intestinal tract[J].Applied and Enviornment Microbiology,2009,75(6):1534-1545.

[9] Li HC,Bouchara JP,Hsu MM,et al.Identification of dermatophytes by an oligonucleotide array[J].J Clin Microbiol,2007,45(10):3160-3166.

[10] Pablo A,Jose L.Selection of enzymes for terminal restriction fragment length polymorphism analysis of fungal internally transcribed spacer sequences[J].Applied and Enviornment Microbiology,2009,75(14):4747-4752.

[11] Prasanna D,Daisy L,David N.Sequencing and analysis of fungal r RNA operons for development of broad-range fungal PCR assays[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(6):1559-1565.

[12] Bobby L,Boyanton,Ruth Ann Luna,et al.DNA pyrosequencingbased identification of pathogenic Candida species by using the internal transcribed spacer 2 region[J].Archives of Pathology＆Laboratory Medicine,2008,132(4):667-674.

[13] Adam H,Groenewald M,Mohan S,et al.Identification of a new species,Candida subhashii,as a cause of peritonitis[J].Med Mycol,2009,47(3):305-311.

[14] Yong PV,Chong PP,Lau LY,et al.Molecular identification of Candida orthopsilosis isolated from blood culture[J].Mycopathologia,2008,165(2):81-87.

[15] Travis Henry,Peter C,StevenH,et al.Identification of Aspergillus species using internal transcribed spacer regions 1 and 2[J].J Clin Microbiol,2000,38(4):1510-1515.

[16] Hans P,Steven F,Timothy J,et al.Assessment of ribosomal large-subunit D1-D2,internal transcribed spacer 1,and internal transcribed spacer 2 regions as targets for molecular identification of medically important Aspergillus species[J].J Clin Microbiol,2005,43(5):2092-2103.

[17] Masakazu K,Sarah K,Akikazu A,et al.The internal transcribed spacers and 5.8S rRNA gene show extensive diversity among isolates of the Cryptococcus neoformansspecies complex[J].FEMS Yeast Research,2004,4(4):377-388.

[18] Watanabe S,Kawasaki M,Mochizuki T,et al.RFLPanalysis of the internal transcribed spacer regions of Sporothrix schenckii[J].Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi,2004,45(3):165-175.

[19] 王英,顧軍,劉維達(dá).用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物的聚合酶鏈反應(yīng)快速測定念珠菌菌種[J].臨床皮膚科雜志,2003,32:69-71.

[20] 駱志成,王端禮,李若瑜,等.煙曲霉 rRNA基因 ITS區(qū)的克隆測序分析[J].菌物系統(tǒng),2000,19:336-341.

[21] 竇紅濤,李若瑜,萬喆,等.臨床常見鐮刀菌的鑒別[J].中國真菌學(xué)雜志,2008,3(5):276-279.

[22] 王永晨,王連明,路娟.應(yīng)用特異性引物鑒定人申克孢子絲菌感染[J].中國試驗診斷學(xué),2009,13:1504-1507.

[23] 陳敏,廖萬清,吳紹熙,等.新生隱球菌變種間 ITS序列差異的研究[J].中華皮膚科雜志,2007,40:230-233.

[24] Hay RJ,Jones RM.New molecular tools in the diagnosis of superficial fungal infections[J].Clin Dermatol,2010,28(2):190-196.