蛋白質(zhì)分子量測試方法概述

譚和平，王彧婕，鄒 燕，譚福元，徐文平

（中國測試技術(shù)研究院，四川 成都 610021）

0 引 言

隨著后基因組時代的到來，生命科學(xué)進(jìn)入了蓬勃發(fā)展的新階段，蛋白質(zhì)及其結(jié)構(gòu)、功能、活性、蛋白質(zhì)組學(xué)等的研究發(fā)展非常迅速。作為蛋白質(zhì)主要特征參數(shù)之一的分子量，是確定一種新型蛋白、進(jìn)行蛋白質(zhì)的后續(xù)研究活動的重要前提。因此，研究蛋白質(zhì)的分子量測試方法，準(zhǔn)確有效地對蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行測定，是十分緊迫的工作。

蛋白質(zhì)分子量的測試方法有很多，有應(yīng)用最廣泛和成熟的凝膠電泳法，以及凝膠色譜法、鹽析沉淀法、激光光散射法，特別是近年來技術(shù)日益成熟、發(fā)展迅速的生物質(zhì)譜技術(shù)（包括電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)以及基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)）等，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域不可或缺的工具。該文將對凝膠電泳法、高效凝膠過濾色譜-激光光散射聯(lián)用以及生物質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行簡要的介紹。

1 凝膠電泳法

凝膠電泳是根據(jù)分子物理性質(zhì)（如電荷、大小、形狀）的不同而實(shí)現(xiàn)分離的一類分析技術(shù)，它分為聚丙烯酰胺凝膠電泳法、毛細(xì)管凝膠電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法等。聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）是蛋白質(zhì)分子量測試中應(yīng)用最廣泛的一類傳統(tǒng)方法，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移取決于它所帶電荷及分子大小和形狀等因素。在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入十二烷基硫酸鈉（SDS）作為變性劑和助溶劑，大多數(shù)蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合，形成帶相同密度負(fù)電荷的復(fù)合物。它的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別，使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量，而與蛋白質(zhì)所帶的電荷無關(guān)。因此，可根據(jù)電泳遷移率求得其相對分子量。Cohen等[1]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和測試蛋白質(zhì)和多肽的分子量。在該研究中，肌紅蛋白碎片和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合物被證明能夠通過20 cm長、有40000個理論塔板的分離柱進(jìn)行有效快速的分離，從而得到其相對分子量。

SDS-PAGE法對蛋白質(zhì)樣品的需求量大，染色費(fèi)時，操作過程較為繁瑣且重現(xiàn)性較差。此外，在測試蛋白質(zhì)分子量的過程中，要特別注意溶液中SDS單體的濃度，保證SDS同蛋白質(zhì)的比例在一個恰當(dāng)?shù)臄?shù)值，才能夠使得蛋白質(zhì)分子同SDS單體充分結(jié)合，以消除蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別；否則，最后得到的蛋白質(zhì)分子量就會有較大的誤差。因此，該技術(shù)在分子量測試方面已被其他先進(jìn)技術(shù)所取代。

2 高效凝膠過濾色譜-多角度激光光散射技術(shù)

凝膠色譜法是根據(jù)溶劑分子尺寸的不同進(jìn)行分離的一種液相色譜法，利用高分子溶液通過填充有多孔的特種凝膠離子的柱子，把分子按從大到小的順序流出進(jìn)行分離。它是一種設(shè)備簡單、操作方便的分離分析技術(shù)，對高分子物質(zhì)有很好的分離效果。高效凝膠過濾色譜作為一種分離技術(shù)，常同多角度激光光散射儀等絕對質(zhì)量分析器聯(lián)用測試蛋白質(zhì)分子量。Ye等[2]采用高效凝膠過濾色譜-激光光散射法同時測定蛋白質(zhì)的聚集、降解以及絕對分子質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)中對蛋白質(zhì)及其聚合體采用高效凝膠過濾色譜分離，多角度激光光散射檢測器進(jìn)行測試，實(shí)驗(yàn)研究的方法可以一次進(jìn)樣后同時對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行定量和分子量測定。丁厚強(qiáng)等[3]采用多角度激光光散射儀與凝膠色譜聯(lián)用測定了透明質(zhì)酸鈉（HA）相對分子質(zhì)量及其分布。

高效凝膠過濾色譜-多角度激光光散射技術(shù)分離測試蛋白質(zhì)分子量的缺點(diǎn)在于對分子形狀的要求較高，需要標(biāo)準(zhǔn)蛋白與待測蛋白的分子形狀一致，測定結(jié)果才較為準(zhǔn)確。因此，在不清楚待測蛋白分子形狀的情況下，測試誤差較大，應(yīng)用有很大的局限性。

3 生物質(zhì)譜技術(shù)

1906年，Thomson發(fā)明了質(zhì)譜技術(shù)，最初只是用于無機(jī)化學(xué)中的同位素分析，直至20世紀(jì)40年代末才發(fā)展成為有機(jī)質(zhì)譜。近年來，生物質(zhì)譜技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，其中以電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）的貢獻(xiàn)最為突出。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)，使得生物大分子電離產(chǎn)生氣相離子成為可能，傳統(tǒng)的用于小分子研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性變革，它能夠準(zhǔn)確分析分子量從幾萬到幾十萬的生物大分子。同時，質(zhì)譜在生物大分子的測定中還具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，也使得質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域得到長足發(fā)展。

3.1 電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)

電噴霧離子化質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS）是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相的質(zhì)譜技術(shù)。

1984年美國耶魯大學(xué)教授Fenn J B首次發(fā)表了電噴霧技術(shù)在質(zhì)譜檢測中的應(yīng)用，并隨后報道了運(yùn)用ESI-MS進(jìn)行蛋白質(zhì)分析的科學(xué)研究[4]。Fenn的研究成果揭開了ESI-MS用于生物大分子研究的序幕，并推動了溶液體系中多肽與蛋白質(zhì)分析的巨大發(fā)展。Fenn J B也因此獲得了2002年諾貝爾化學(xué)獎。

ESI-MS測定蛋白質(zhì)大分子是根據(jù)一簇多電荷的質(zhì)譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質(zhì)的分子量，由于ESI-MS可以產(chǎn)生多電荷峰，因此使得測試的分子質(zhì)量范圍大大擴(kuò)大。Green等[5]采用ESI-MS對質(zhì)量差別很小的蛋白質(zhì)分子量進(jìn)行了區(qū)分和測定，顯示了質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分子量測試上的優(yōu)勢。孔毅等[6]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效凝膠過濾色譜以及電噴霧離子化質(zhì)譜3種方法對新發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，電噴霧離子化質(zhì)譜同理論分子量最為接近，是目前測試蛋白質(zhì)分子量最準(zhǔn)確的方法之一。另外，研究表明，在溶液中加入改性劑可輔助蛋白質(zhì)分子的離子化和去溶劑化，大大提高蛋白質(zhì)分子測定的靈敏度。如根據(jù)蛋白質(zhì)含有較多的堿性氨基酸的特點(diǎn)，在溶液中加入適當(dāng)?shù)乃嵝栽噭?，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的離子化。Sunia等[7]還討論了ESI-MS在測定蛋白質(zhì)分子量過程中受pH值的影響情況，實(shí)驗(yàn)表明流動相在較低的pH環(huán)境下，有利于正離子模式下含氮堿基化合物的離子化；流動相在較高的pH環(huán)境下，有利于負(fù)離子模式下含酸性基團(tuán)的樣品的離子化。Voyksner[8]的研究表明甲醇、乙醇、異丙醇等具有較小表面張力的溶劑有利于ESI-MS實(shí)驗(yàn)中含水溶劑的去溶劑化，同時可以稀釋緩沖鹽至質(zhì)譜正常工作范圍內(nèi)。隨著電噴霧電離技術(shù)的廣泛應(yīng)用，它對多肽和蛋白質(zhì)等的生物質(zhì)譜分析已不僅僅局限于分子量的測試，而在近年來取得了長足的發(fā)展。通過HPLC-ESI-MS聯(lián)用儀分析酶解后的碎片，不需要任何純化便可用來檢測目標(biāo)肽段[9]，進(jìn)而確定蛋白質(zhì)序列、確定和鑒別翻譯后修飾、測定蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物等重要工作；ESI-MS還可以分析肽的合成產(chǎn)物、研究非共價蛋白復(fù)合物以及對寡核苷酸進(jìn)行測定等。

ESI-MS的優(yōu)勢在于：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費(fèi)；（2）對樣品分子質(zhì)量測試靈敏度、分辨力和準(zhǔn)確度都相當(dāng)高；（3）能夠方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)用，如毛細(xì)管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性、極性強(qiáng)的復(fù)雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。

3.2 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中[6]，基體與待測物形成混晶，當(dāng)基體吸收激光的能量后，均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化并離子化。基體的作用在于保護(hù)待測物不會因過強(qiáng)的激光能量導(dǎo)致化合物被破壞。

1987年，日本Shimadzu公司工程師Koichi Tanaka利用基質(zhì)輔助激光解吸方法成功測定了生物大分子，隨后德國科學(xué)家Karas M和Hillenkamp F利用有機(jī)基質(zhì)（煙堿酸）成功測試了多種蛋白質(zhì)和寡核苷酸，開啟了MALDI-MS在蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的新篇章[7]。2002年諾貝爾化學(xué)獎同時也頒發(fā)給了Koichi Tanaka，以表彰他在生物大分子測量領(lǐng)域的卓越貢獻(xiàn)。季怡萍等[10]采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法測定了鈣調(diào)蛋白的純度與分子量，并對所得的結(jié)果進(jìn)行了討論，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好、信息直觀等特點(diǎn)，是其他傳統(tǒng)測定蛋白質(zhì)分子量的方法無法比擬的。Jeannot等[11]采用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜對由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確分子量測定。實(shí)驗(yàn)對凝膠成分十二烷基硫酸鈉、甘油以及三羥甲基氨基甲烷緩沖液對質(zhì)譜信號的影響進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，甘油及三羥甲基氨基甲烷緩沖液對質(zhì)譜分辨力和準(zhǔn)確度幾乎沒有影響，但即使是在低濃度情況下，十二烷基硫酸鈉也會使得質(zhì)譜的靈敏度、分辨力和準(zhǔn)確度降低。在樣品前處理中，采取了在凝膠中去除過多SDS的方法，減少了峰形過寬對蛋白質(zhì)分子量精確測定的影響。此外，基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)的發(fā)展，使MALDI-MS在蛋白質(zhì)鑒定、蛋白質(zhì)相對定量、蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)鑒定和定量、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、核酸分析-序列確認(rèn)等方面都有很好的應(yīng)用。

MALDI-MS的優(yōu)勢在于：（1）同ESI-MS一樣對樣品的消耗很少；（2）隨著質(zhì)量分析器的不斷改進(jìn)、新的基質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用以及延遲萃取技術(shù)的使用，使得MALDI-MS的最高分辨率不斷提高，甚至超過 ESI-MS[4]；（3）MALDI-MS 單電荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于對復(fù)雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發(fā)成分，降低了對樣品預(yù)處理的要求；（4）MALDI-TOF質(zhì)譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術(shù)中最廣的。

4 結(jié)束語

蛋白質(zhì)分子量測試技術(shù)是蛋白質(zhì)相關(guān)測量工作的基礎(chǔ)，隨著基因組計劃的快速、全方位的推進(jìn)，蛋白質(zhì)分子量測定的科學(xué)研究工作必將受到越來越廣泛的關(guān)注。ESI-MS和MALDI-MS是目前測定蛋白質(zhì)分子量最先進(jìn)的方法，兩者在樣品消耗量、測試靈敏度、分辨力和準(zhǔn)確度上都達(dá)到很高的水平。ESI-MS的缺點(diǎn)在于對樣品純度要求高，且會形成多電荷的質(zhì)譜峰群，難以分辨，使得結(jié)果分析較為困難。如，ESI-MS在分析糖蛋白時會產(chǎn)生大量的重疊峰[12]。相比于ESI-MS，MALDI-MS對樣品純度要求低，能夠測定純度不高的混合物，降低對樣品預(yù)處理的要求；并且對蛋白質(zhì)分子量的測試范圍比ESI-MS更廣，是未來蛋白質(zhì)等生物大分子分子量測定的主流工具。但是，MALDI-MS與高效液相色譜、毛細(xì)管電泳等分離設(shè)備的聯(lián)用，目前只能采取離線的方式，致使分析結(jié)果的重復(fù)性較差，與MALDI-MS本身高精密度的特性不匹配，如果能有效解決MALDI-MS與預(yù)分離技術(shù)的聯(lián)用問題，必將會使其在生命科學(xué)領(lǐng)域獲得更廣泛的應(yīng)用，發(fā)揮更大的作用。

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