流式細(xì)胞術(shù)的工作原理及其臨床應(yīng)用

吳曉娜，蔣紅兵

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院設(shè)備科，江蘇 南京 210006

流式細(xì)胞術(shù)的工作原理及其臨床應(yīng)用

吳曉娜，蔣紅兵

南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院設(shè)備科，江蘇 南京 210006

流式細(xì)胞術(shù)是一種可對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行快速定性、定量分析的新技術(shù)。隨著其分析技術(shù)和方法的日臻完善，流式細(xì)胞術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床及科學(xué)研究上發(fā)揮了非常重要的作用。本文對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的工作原理進(jìn)行了概括介紹，并對(duì)其在腫瘤學(xué)、血液學(xué)及免疫學(xué)等方面的臨床應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

流式細(xì)胞術(shù)；工作原理；臨床應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry,FCM）是20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù),它集計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體，是對(duì)快速直線運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞、生物顆?；蛞后w中的大分子物質(zhì)進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的一種技術(shù)。它可測(cè)量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀；可檢測(cè)細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原，細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等；可對(duì)群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析，并能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)分析大量細(xì)胞，以及收集、儲(chǔ)存和處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行多參數(shù)定量分析；能夠分類收集（分選）某一亞群細(xì)胞，分選純度超過95%。隨著各種相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)已成為日益完善的分析細(xì)胞學(xué)和腫瘤標(biāo)志學(xué)研究的重要工具。

1 流式細(xì)胞儀的結(jié)構(gòu)及工作原理

流式細(xì)胞儀主要分為科研型（又稱大型機(jī)、分析型）和臨床型（又稱小型機(jī)、臺(tái)式機(jī)）兩類，科研型的儀器功能齊全，分析靈活，但操作較繁瑣，必須由經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員進(jìn)行操作；臨床型的儀器易于操作，穩(wěn)定性好，分析速度快，適合在臨床實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用。流式細(xì)胞儀主要由以下五部分構(gòu)成：① 流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)；② 激光光源及光束形成系統(tǒng)；③ 光學(xué)系統(tǒng)；④ 信號(hào)檢測(cè)與存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)；⑤ 細(xì)胞分選系統(tǒng)。其主要技術(shù)指標(biāo)有分析速度、熒光檢測(cè)靈敏度、前向角散射（FSC）光檢測(cè)靈敏度、分辨率、分選速度等。

流式細(xì)胞儀的工作原理是將待測(cè)標(biāo)本制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿流動(dòng)的鞘液；當(dāng)鞘液壓力和樣品壓力的壓力差達(dá)到一定程度時(shí)，在鞘液的約束下細(xì)胞排列成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱經(jīng)過激光聚焦區(qū)，與入射的激光束垂直相交，經(jīng)特異性熒光染料染色的細(xì)胞被激光激發(fā)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光；儀器中一系列光學(xué)系統(tǒng)，如透鏡、光闌、濾片和檢測(cè)器等，收集熒光、光散射、光吸收或細(xì)胞電阻抗等信號(hào)；計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行收集、儲(chǔ)存、顯示并分析被測(cè)定的各種信號(hào)，對(duì)各種指標(biāo)做出統(tǒng)計(jì)分析[1]。

科研型流式細(xì)胞儀還可以根據(jù)所規(guī)定的參量把指定的細(xì)胞亞群從整個(gè)群體中分選出來，其分選原理是把液滴形成的信號(hào)加在壓電晶體上使之產(chǎn)生機(jī)械振動(dòng)，流動(dòng)室即隨之振動(dòng)，使液柱斷裂成一連串均勻的液體。一部分液滴中包有細(xì)胞，而細(xì)胞特質(zhì)是在進(jìn)入液滴以前已經(jīng)被測(cè)定了的，如果其特征與被選定要進(jìn)行分選的細(xì)胞特征相符，則儀器在這個(gè)被選定的細(xì)胞剛形成液滴時(shí)給整個(gè)液柱充以指定的電荷，使被選定的細(xì)胞形成液滴時(shí)就帶有特定的電荷，而未被選定細(xì)胞形成的細(xì)胞液滴和不包含細(xì)胞的空白液滴不被充電。帶有電荷的液滴向下落入偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場(chǎng)時(shí)，按照所帶電荷符號(hào)向左或向右偏轉(zhuǎn)，落入指定的收集器內(nèi)，完成分類收集的目的。對(duì)分選出的細(xì)胞可以進(jìn)行培養(yǎng)或其他處理，做更深入的研究。

2 流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用

2.1 在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用主要是利用DNA含量測(cè)定進(jìn)行包括癌前病變及早期癌變的檢出、化療指導(dǎo)以及預(yù)后評(píng)估等工作[2]。惡性腫瘤的早期診斷是提高治愈和生存率的關(guān)鍵，良惡性腫瘤的鑒別診斷對(duì)于確定臨床治療方案具有決定性作用。迄今為止病理形態(tài)學(xué)診斷一直被視為腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于某些腫瘤，特別在早期缺乏客觀明確的診斷指標(biāo)，不能提高診斷的正確率。

流式細(xì)胞術(shù)的出現(xiàn)給腫瘤的病理學(xué)診斷帶來了飛躍，特別是用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞DNA含量，分辨率高、精確度好，可為判斷腫瘤的生物學(xué)行為提供客觀而準(zhǔn)確的資料，輔助腫瘤的早期診斷和鑒別診斷。癌前病變是指某些具有癌變潛能的病變，正確識(shí)別癌前病變對(duì)早期診斷和預(yù)防惡性腫癌具有重要的實(shí)際意義。然而臨床上所謂癌前病變所包括的實(shí)際上是一大組生物學(xué)行為迥異的病變，其中一小部分具潛在癌變可能，而大部分完全是良性病變，因此要用病理形態(tài)學(xué)手段將其區(qū)別開來。只有那些不典型增生或稱異型增生的上皮具癌變潛能，為了進(jìn)一步區(qū)別不典型增生上皮癌變潛能的大小，通常根據(jù)其增生程度和形成表現(xiàn)將其分為I、II、III三級(jí)，分級(jí)越高，惡變可能性越大。DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個(gè)重要指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)可精確定量DNA含量的改變，即檢測(cè)出DNA非整倍體的出現(xiàn)，并將其作為診斷癌前病變發(fā)展至癌變中的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志，從而對(duì)癌前病變的性質(zhì)及發(fā)展趨勢(shì)做出評(píng)估，有助于癌變的早期診斷[3]。其具體方法是先將實(shí)體瘤組織解聚、分散制備成單細(xì)胞懸液，再用熒光染料（碘化吡啶P1）染色后對(duì)細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行分析，最后將不易區(qū)分的群體細(xì)胞分成三個(gè)亞群（G0/G1期、S期、G2期），DNA含量直接代表細(xì)胞的倍體狀態(tài)，非倍體細(xì)胞與腫瘤惡性程度有關(guān)。DNA非整倍體細(xì)胞峰的存在可為腫瘤診斷提供有力證據(jù)[4]。有資料證實(shí)，癌前病變的癌變發(fā)生率與細(xì)胞不典型增生程度有密切關(guān)系，增生程度越重，癌變發(fā)生率越高。

流式細(xì)胞術(shù)不僅可以對(duì)惡性腫瘤DNA含量進(jìn)行分析，還可根據(jù)化療過程中腫瘤DNA分布直方圖的變化去評(píng)估療效，了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化，在腫瘤化療方面的意義尤為顯著。臨床工作人員可根據(jù)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布情況，結(jié)合化療藥物對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論，設(shè)計(jì)最佳治療方案，再依照DNA直方圖直接地看到腫瘤細(xì)胞的殺傷變化，及時(shí)調(diào)整治療方案，選取有效藥物以使對(duì)腫瘤細(xì)胞達(dá)到最大的殺傷效果[5-8]。

2.2 在免疫學(xué)中的應(yīng)用

機(jī)體免疫狀態(tài)是機(jī)體是否罹患疾病的重要指標(biāo)，目前多采用流式細(xì)胞術(shù)來監(jiān)測(cè)機(jī)體的免疫狀態(tài)，其中最重要的指標(biāo)是T、B和NK淋巴細(xì)胞的水平。T細(xì)胞主要包括Th和Ts細(xì)胞亞群。CD3細(xì)胞代表外周血中總的成熟T細(xì)胞，理論上應(yīng)約等于CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞的總和。但我們檢測(cè)患者T細(xì)胞及其亞群時(shí)，往往出現(xiàn)CD4+加CD8+細(xì)胞之和大于CD3的情況。這是因?yàn)镃D4+細(xì)胞其實(shí)包括兩部分：CD3+/CD4+細(xì)胞（真正的Th細(xì)胞）和CD3-/CD4+細(xì)胞（非Th細(xì)胞）；CD8細(xì)胞也包括兩部分細(xì)胞：CD3+/CD8+細(xì)胞（真正Ts細(xì)胞）和CD3-/CD8+細(xì)胞（非Ts細(xì)胞）。而CD3-/CD8+細(xì)胞又可以分為兩組：一組為CD3-/CD8+/CD（16+56）+細(xì)胞（即NK細(xì)胞的一部分）；另一組為CD3-/CD8+/CD（16+56）-（一群未知細(xì)胞）。由此可見，真正的Th細(xì)胞是CD3+/CD4+細(xì)胞，真正Ts細(xì)胞是CD3+/CD8+細(xì)胞。若使用CD4或CD8單標(biāo)單抗或CD4與CD8雙標(biāo)抗體來檢測(cè)Th和Ts，而不用CD3抗體進(jìn)行限定，測(cè)出的結(jié)果必然會(huì)偏離真實(shí)值。尤其當(dāng)患者NK細(xì)胞明顯增加時(shí)，會(huì)使CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞的總和遠(yuǎn)大于CD3+細(xì)胞。因此，一定用三色熒光標(biāo)記才能分析真正的輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞。首先在淋巴細(xì)胞中識(shí)別出CD3細(xì)胞，然后在CD3細(xì)胞中再區(qū)分CD4+和CD8+細(xì)胞。

自然殺傷細(xì)胞（NK），又稱裸細(xì)胞，因其表面沒有類似T細(xì)胞和B細(xì)胞的表面標(biāo)志。后來隨著免疫力學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了NK細(xì)胞的一些表面標(biāo)志，如CD16、CD56等，但單用CD16和CD56的抗體無法正確鑒定出NK細(xì)胞，因此必須使用CD（16+56）抗體。這里還有一點(diǎn)必須引起足夠重視，即NK細(xì)胞一定是CD3陰性表達(dá)細(xì)胞。所以CD3-/CD（16+56）+細(xì)胞才是真正的NK細(xì)胞。

B細(xì)胞的表面標(biāo)志是CD19，理論上CD3-/CD19+細(xì)胞才是真正的B淋巴細(xì)胞。但實(shí)際檢測(cè)中，CD3+/CD19+細(xì)胞很少，可以忽略不計(jì)，所以CD19+細(xì)胞就是B淋巴細(xì)胞[9-14]。

利用抗原抗體特異性反應(yīng)原理，將不同單克隆抗體設(shè)法帶上各種熒光染料作為熒光標(biāo)記（熒光探針），這種熒光探針與單克隆抗體能牢牢結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞被激光器發(fā)射的激光照射后，細(xì)胞膜的抗原抗體復(fù)合物上的熒光探針可以發(fā)射出不同光譜的繼發(fā)熒光，帶熒光探針的單克隆抗體與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原的結(jié)合的繼發(fā)熒光量轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，這就代表了細(xì)胞表面的抗原量。這些熒光通過流式細(xì)胞儀的識(shí)別和分辨，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表面抗原的定量檢測(cè)。細(xì)胞免疫反應(yīng)一般分兩種：直接免疫反應(yīng)，即細(xì)胞表面抗原與帶熒光探針的單克隆抗體特異結(jié)合的免疫反應(yīng)；間接免疫反應(yīng)，細(xì)胞表面的抗原與單克隆抗體結(jié)合，帶熒光的第二抗體又與抗體結(jié)合，也使這個(gè)抗原-抗體復(fù)合物也帶上熒光探針。

流式細(xì)胞術(shù)與單克隆抗體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原、癌基因蛋白及膜受體的定量檢測(cè)取得很大的進(jìn)展，克服了普通免疫學(xué)方法難以準(zhǔn)確定量的不足。這一技術(shù)對(duì)于人體細(xì)胞免疫功能的評(píng)估有重要意義。通過檢測(cè)各種免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志及細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子等，通過對(duì)病人淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測(cè)定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)，指導(dǎo)治療。流式細(xì)胞術(shù)通過對(duì)人白細(xì)胞抗原（HLA）配型的測(cè)定可以為異體干細(xì)胞移植病人選擇出最合適的供體并進(jìn)行骨髓或器官移植后免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)[15]。此外，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞、粒細(xì)胞抗體及血小板減少性疾病，均有檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[16]。

2.3 在血液學(xué)中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)通過對(duì)外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測(cè)分析，對(duì)各種血液病的診斷、治療和預(yù)后判斷起到重要作用。流式細(xì)胞術(shù)采用各種抗血細(xì)胞表面分化抗原的單克隆抗體，借助于各種熒光染料測(cè)定一個(gè)細(xì)胞的多種參數(shù)，以正確地判斷出該細(xì)胞的屬性。各種血細(xì)胞系統(tǒng)都有其獨(dú)特的抗原，當(dāng)形態(tài)學(xué)檢查難以區(qū)別時(shí)，免疫表形參數(shù)對(duì)各種急性白血病的診斷和鑒別就起了舉足輕重的作用。

流式細(xì)胞術(shù)還可以應(yīng)用在白血病免疫分型方面。目前國(guó)內(nèi)外均主張采用FCM CD45/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)計(jì)方法進(jìn)行白血病免疫分型，采用此法可將骨髓細(xì)胞清晰地分成淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、成熟粒細(xì)胞、幼稚細(xì)胞和有核紅細(xì)胞群，這樣可以排除正常細(xì)胞對(duì)免疫分型的干擾，從而提高免疫分型的準(zhǔn)確性[17]。

此外，流式細(xì)胞術(shù)在網(wǎng)織紅細(xì)胞的測(cè)定及應(yīng)用、血栓與止血中的應(yīng)用、微小殘留病灶（MRD）的檢測(cè)等方面均有廣泛的應(yīng)用。

2.4 在其他方面的應(yīng)用

隨著近年來流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展以及與臨床工作結(jié)合的緊密性日益加強(qiáng)，F(xiàn)CM已廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，通過對(duì)多藥耐藥基因、凋亡抑制基因及凋亡活化基因表達(dá)的測(cè)定、檢測(cè)器官移植后血液或移植內(nèi)免疫成分變化、與熒光染料聯(lián)合應(yīng)用判斷細(xì)菌的活力和功能狀態(tài)等方法，在細(xì)胞凋亡和多藥耐藥基因檢測(cè)、器官移植、臨床細(xì)菌學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、優(yōu)生遺傳領(lǐng)域等都得到了充分的應(yīng)用，有著廣闊的前景。

3 結(jié)語(yǔ)

流式細(xì)胞術(shù)以其分辨率高、分辨細(xì)胞數(shù)量大、參數(shù)多、準(zhǔn)確性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中，并逐步成為醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域中極具發(fā)展?jié)摿Φ母呒夹g(shù)平臺(tái)。隨著流式細(xì)胞分析技術(shù)與方法的迅速發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)在臨床的應(yīng)用范圍也不斷拓展，并將成為推動(dòng)臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要手段之一。

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Working Principle and Clinical Application of Flow Cytometry

WU Xiao－na,JIANG Hong－bing
Equipment Department,Nanjing First Hospital Affiliated to Nanjing Medical University,Nanjing Jiangsu 210006,China

R459.5；R446.11+3

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2011.03.033

1674-1633(2011)03-0091-03

2011-01-06

2011-03-09

作者郵箱：naiadsnowal@163.com

Abstract:Flow cytometry is a new kind of technology which can analyze single cells by qualitative analysis and quantitative analysis quickly. With the development of analyzing techniques and methods, flow cytometry has being played an important role in the clinical medicine and scientific research. This paper introduced the working principle of flow cytometry synoptically and summarized its clinical application in oncology, hematology and immunology, etc.

Key words:flow cytometry; working principle; clinical application