細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的合理使用及質(zhì)量控制

王成艷 韓景田 買 霞

①武警醫(yī)學(xué)院教保處 天津 300162

細(xì)胞培養(yǎng)主要是指細(xì)胞在體外條件下的培養(yǎng)技術(shù)，亦即在無菌情況下，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和增殖[1]。包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)等都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價值。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究中得到了極為廣泛的應(yīng)用，在整個生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對臨床醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的學(xué)習(xí)和研究大有幫助。除潔凈的室內(nèi)環(huán)境外，與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)有關(guān)的設(shè)備和器材主要有二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌器、濾菌器及玻璃器皿等。結(jié)合我們的工作實踐，談?wù)劶?xì)胞培養(yǎng)設(shè)備的合理使用及質(zhì)量控制。

1 CO2培養(yǎng)箱

CO2培養(yǎng)箱價格昂貴，溫度和氣體濃度傳感器靈敏，如果在使用過程中操作不當(dāng)，容易導(dǎo)致儀器損壞，影響正常工作和儀器使用壽命。CO培養(yǎng)箱內(nèi)的進(jìn)氣壓要求為0.06 MPa。開門后，箱內(nèi)氣體散發(fā),壓力下降。關(guān)門后氣體傳感器在低壓刺激下有節(jié)奏地開閉，向箱內(nèi)充氣，當(dāng)進(jìn)氣壓達(dá)到0.06 MPa時,自動停止調(diào)節(jié)。因此，在日常使用過程中，盡量避免不必要的打開培養(yǎng)箱，從而減少傳感器的工作負(fù)荷，延長其使用壽命[2]。放置CO2培養(yǎng)箱的實驗室室溫應(yīng)保持在25 ℃左右，溫度過高會影響CO2培養(yǎng)箱的溫控裝置。CO2培養(yǎng)箱使用過程中，要求在箱內(nèi)托盤中放一定量的滅菌水，使箱內(nèi)為飽和濕度環(huán)境，這是針對開放培養(yǎng)細(xì)胞要求設(shè)計的，有利于細(xì)胞生長[3]。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時，要每天觀察二氧化碳壓力表，及時更換二氧化碳鋼瓶。培養(yǎng)箱內(nèi)應(yīng)放置一溫度計，記錄其溫度與指示表溫度是否一致。箱內(nèi)應(yīng)劃分不同區(qū)域,不同細(xì)胞應(yīng)放不同區(qū)域[4]。此外，CO2培養(yǎng)箱的箱內(nèi)要經(jīng)常消毒，以免細(xì)菌污染，影響細(xì)胞培養(yǎng)。

2 倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。倒置顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。倒置顯微鏡中最常用的觀察方法就是相差。由于這種方法不要求染色，是觀察活細(xì)胞的理想方法。應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)操作規(guī)則使用顯微鏡，避免因使用不當(dāng)造成損毀。觀察細(xì)胞時，按照先低倍后高倍的物鏡選擇方法，每次使用完畢后應(yīng)及時做好清潔工作[5]。所有鏡頭表面必須保持清潔，落在鏡頭表面的灰塵，可用吸耳球吹去，也可用軟毛刷輕輕的撣去掉。當(dāng)鏡頭表面沾有油污或指紋時，可用脫脂棉蘸少許無水乙醇和乙醚的混合液（3∶7）輕輕擦拭。不能用有機(jī)溶液清擦其它部件表面，特別是塑料零件，可用軟布蘸少量中性洗滌劑清擦。在任何情況下操作人員不能用棉團(tuán)、干布塊或干鏡頭紙擦試鏡頭表面，否則會刮傷鏡頭表面，嚴(yán)重?fù)p壞鏡頭，也不要用水擦試鏡頭，這樣會在鏡頭表面殘留一些水跡，而滋生霉菌，嚴(yán)重?fù)p壞顯微鏡。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)時，要輕拿輕放，防止細(xì)胞被顯微鏡污染或損壞鏡頭。

3 超凈工作臺

超凈工作臺是一種局部層流裝置，提供局部高潔凈度環(huán)境，使工作環(huán)境無菌無塵的一種空氣凈化設(shè)備。為了保證超凈化工作臺的潔凈度，使用前30 min應(yīng)開啟風(fēng)速開關(guān)和紫外線開關(guān)，進(jìn)行紫外線照射,以保證操作區(qū)有潔凈空氣環(huán)境，包括移液器、試管架、鑷子等。超凈臺內(nèi)也應(yīng)劃分不同的區(qū)域,如材料區(qū)、操作區(qū)、污物區(qū)等。注意安全,特別是酒精燈,如有酒精漏出應(yīng)立即吸干擦凈,以免發(fā)生意外。實驗完畢,所用過的器皿、雜物必須清理,同時進(jìn)行臺面清潔，使工作臺處于最佳狀態(tài)，同時定期拆洗或更換預(yù)過濾器中的無紡布濾料。經(jīng)常用酒精或丙酮等擦拭紫外線燈管，保持表面清潔，否則影響殺菌能力[6]。

4 高壓蒸汽滅菌器

高壓蒸汽滅菌的效果直接影響細(xì)胞培養(yǎng)時細(xì)胞的生長狀況。滅菌不當(dāng)，容易造成細(xì)菌對培養(yǎng)細(xì)胞的污染。滅菌器內(nèi),裝放擬滅菌物品不應(yīng)過擠,其總體積不應(yīng)超過其容積的80%，物品裝放時，上下左右均應(yīng)互相間隔一定距離，以利于蒸汽與空氣相互交換，,難于滅菌的大物品放上層，較易滅菌的小物品放在下層。滅菌前應(yīng)對滅菌器各部位進(jìn)行常規(guī)檢查。滅菌時，當(dāng)壓力指示表升至0.35 kg/cm2時，開放排氣閥，排凈冷空氣后再關(guān)閉，以使滅菌器內(nèi)真正達(dá)到預(yù)定的溫度。否則壓力表上所示壓力并非全部蒸汽壓，滅菌將不完全。滅菌完畢后，不可突然開大排氣閥門排氣減壓，以免因器內(nèi)壓力驟然下降而瓶內(nèi)液體沸騰，沖出瓶外。

5 濾菌器

細(xì)胞培養(yǎng)時，對培養(yǎng)基的除菌方法通常采用濾菌器除菌，即采用濾膜濾器除菌。濾膜濾器是用金屬容器將孔徑不同的醋酸纖維薄膜（濾膜）夾在中間，進(jìn)行過濾除菌。常用的濾膜的規(guī)格有0.22 um、0.35 um、0.45 um、0.65 um、0.8 um等幾種。使用時，先將濾膜放入雙蒸水中浸泡12 h以上，平鋪于金屬濾器上。為防止濾膜破損，通常使用雙層濾膜，上層使用孔徑大一點的濾膜（0.45 um），下層使用孔徑小一點的濾膜（0.22 um）。固定好后，連同使用的膠管用牛皮紙包好，經(jīng)高壓滅菌1.04 kg/cm215 min，備用。新濾器應(yīng)在流水中徹底洗滌后放在1∶100的鹽酸中浸泡數(shù)小時，再用蒸餾水洗滌，干燥后保存。

6 玻璃器皿

培養(yǎng)用的各種玻璃器皿如玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管等均需經(jīng)過清水浸泡、去污刷洗、酸浸和沖洗以及高壓滅菌等程序。清洗玻璃器皿要求干凈透明、無油跡，不能殘留任何物質(zhì)。因為某些化學(xué)物質(zhì)僅百萬分之一毫克，就會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。玻璃器皿清洗方法：新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前先用自來水簡單刷洗，再用5%鹽酸浸泡過夜，后用試管刷刷洗，但細(xì)胞培養(yǎng)瓶不能刷。將初洗的玻璃器皿放在烘箱中烘干后，放入濃硫酸重鉻酸鉀配制的洗液中至少過夜。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復(fù)“注水－倒空”10次以上，最后用雙蒸水浸洗2～3次，烘干，包裝，高壓滅菌121 ℃、30 min后備用。

[1]盧圣棟.現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)(第二版)[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:430.

[2]趙巍,李小寧.CO2培養(yǎng)箱的使用,保養(yǎng)及故障排除[J].醫(yī)療設(shè)備信息,2006,21(6):97-98.

[3]張麗蕓,盧曉,程寶鸞.二氧化碳培養(yǎng)箱的使用和保護(hù)[J].國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊,2005,26(1):61.

[4]崔冬生,李增寧,顧平,等.細(xì)胞培養(yǎng)室管理規(guī)則[J].華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,6(3):395-396.

[5]韓景田,賀智,王剛.顯微鏡的調(diào)試使用和管理[J].中國醫(yī)學(xué)裝備,2009,6(1):61-62.

[6]劉金芳.凈化工作臺及壓力滅菌器的質(zhì)量控制[J].江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué),2000,11(4):65-66.