抗乙型肝炎病毒治療研究進(jìn)展

張 洪 李青梅 閆紅青 袁華魏 姜艷芳 ?？∑?(吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科，吉林 長春 3002)

乙型病毒性(MBV)肝炎是由HBV引起的傳染性疾病。目前全世界約有4億HBV攜帶者，我國是乙肝高發(fā)區(qū)之一，約有HBV攜帶者1.3億人，每年約有30萬人死于慢性肝炎(CHB)，其中70%的病毒性肝炎是乙型肝炎〔1〕。衛(wèi)生部2008年傳染病疫情統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國乙型肝炎發(fā)病總數(shù)居傳染病發(fā)病總數(shù)的第二位，其死亡總數(shù)居第四位，與2007年同期比較，乙型肝炎死亡率呈上升趨勢。抗病毒治療的目標(biāo)是最大限度地抑制或消除HBV，減少和防止肝臟功能失代償、肝硬化、肝細(xì)胞癌及其并發(fā)癥的發(fā)生，改善患者生活質(zhì)量并延長其存活時(shí)間?，F(xiàn)有抗HBV藥物很少能對cccDNA(covalently closed circular DNA)有降解作用，即使DNA鏈合成終止，病毒仍能以cccDNA為模板，轉(zhuǎn)錄mRNA并繼而翻譯病毒蛋白。針對HBV復(fù)制的特點(diǎn)，抗HBV主要有以下兩種策略:(1)打破免疫耐受，提高人體免疫功能，通過細(xì)胞溶解機(jī)制和非細(xì)胞溶解機(jī)制，清除細(xì)胞內(nèi)的cccDNA;(2)通過長期、有效的抗HBV藥物和治療方法抑制新的HBV合成，使細(xì)胞內(nèi)的cccDNA庫得不到補(bǔ)充而逐漸耗竭〔2〕。針對HBV難治性，隨著抗HBV藥物不斷出現(xiàn)，本文對抗HBV措施研究做一綜述。

1 抗HBV的藥物治療

在目前抗HBV治療中，藥物治療是臨床應(yīng)用的重點(diǎn)，主要分為生物類藥物、化學(xué)類藥物和中草藥及有效成分3類。

1.1 生物類藥物 ①干擾素(IFN):IFN與肝細(xì)胞表面的同種受體結(jié)合，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，激活干擾素激活基因，主要作用是降解HBV復(fù)制的中間體mRNA，來抑制病毒mRNA信息的傳遞以及病毒蛋白的翻譯，從而阻止病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)繁殖。IFN抗病毒作用比較廣泛，對CHB治療長期有效〔3〕。同時(shí)它還能增加在e抗原(HBeAg)陰性CHB患者體內(nèi)表面抗原(HB-sAg)抗原清除率。IFN治療可改善CHB患者的長期預(yù)后，持續(xù)應(yīng)答者發(fā)生肝癌的危險(xiǎn)性及死亡率明顯降低。但近期研究表明，IFN用于治療HBeAg陰性CHB患者有效率為38% ～90%，但停藥后復(fù)發(fā)率較高，僅20% ～25%的患者有長期療效〔4〕。同時(shí)IFN價(jià)格昂貴和副作用明顯，限制了IFN應(yīng)用。②胸腺肽α1:免疫調(diào)節(jié)劑可以提高人體的免疫功能，尤其是對HBV的特異性免疫?？梢宰R(shí)別和破壞HBV感染的靶細(xì)胞，清除HBV。α1胸腺肽是人工合成的多肽，由28個(gè)氨基酸組成。α1胸腺肽的作用機(jī)制可能是激活了HBV特異輔助性T細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對病毒抗原的體液免疫。通過分泌各種細(xì)胞因子，以及加強(qiáng)IL-22(interleukin 22)受體的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞免疫。它為CHB患者提供了新的治療選擇，但從目前的研究結(jié)果來看，其有效率還不甚理想〔5〕。

1.2 化學(xué)類藥物 化學(xué)類藥物分為核苷類藥物和非核苷類似物

1.2.1 核苷類藥物 核苷類化合物的主要作用機(jī)制是抑制HBV DNA聚合酶，導(dǎo)致前基因組RNA無法反轉(zhuǎn)錄為DNA;或與某種dNTP競爭參與HBV DNA合成，整合后終止病毒DNA的延伸。核苷類似物能抑制病毒，并不能清除乙肝病毒，對乙肝病毒cccDNA沒有作用，肝細(xì)胞內(nèi)的HBV能否消除取決于機(jī)體的免疫清除能力〔6〕。①拉米夫定(賀普丁，3TC):與脫氧核糖胞苷三磷酸(dCTP)競爭參與HBV DNA合成，整合后終止病毒DNA的延伸，抑制病毒復(fù)制、肝臟組織炎癥、肝臟組織纖維化進(jìn)展。在肝移植和HIV陽性患者中也有效果。3TC模擬的是胞嘧啶，其結(jié)構(gòu)與人天然胞嘧啶結(jié)構(gòu)不同，只能作用于病毒，而對人體沒有毒性作用。3TC治療乙肝存在兩大問題:一是停藥后反跳問題，二是耐藥性問題。YMDD變異可導(dǎo)致3TC療效下降，與臨床耐藥，肝炎復(fù)發(fā)有相關(guān)性。Thompson等用3TC治療乙型肝炎時(shí)，發(fā)現(xiàn)HBV前核心基因變異、治療6個(gè)月時(shí)還有持續(xù)高病毒血癥以及女性患者更容易發(fā)生3TC耐藥〔7〕。②阿德福韋酯(賀維力):為腺嘌呤磷酸酯化合物阿德福韋(Adefovir，PMEA)的前體藥物，具有抑制對3TC產(chǎn)生耐藥的HBV DNA多聚酶的活性。體內(nèi)外研究結(jié)果表明，阿德福韋酯對HBV野生株和YMDD變異株均有顯著抑制作用〔8〕。對HBeAg陽性CHB患者在抑制HBV DNA復(fù)制同時(shí)，能提高HBeAg轉(zhuǎn)陰率和血清轉(zhuǎn)換率，并使得ALT復(fù)常率明顯提高，而且可以維持對肝病的長期控制。但是HBV對阿德福韋酯也產(chǎn)生耐藥突變，經(jīng)典突變有rtN236T和 rtA181V/T，同時(shí)rtN118H和rtM207V變異也在阿德福韋酯耐藥患者內(nèi)發(fā)現(xiàn)〔9〕。③恩替卡韋(博路定):其抗病毒作用通過三個(gè)方面對HBV的復(fù)制進(jìn)行抑制:聚合酶的引發(fā)、負(fù)鏈的逆轉(zhuǎn)錄及正鏈DNA的復(fù)制。臨床研究表明恩替卡韋能有效選擇性抑制HBV DNA復(fù)制，療效優(yōu)于3TC，治療CHB患者12 w后，HBV DNA轉(zhuǎn)陰率明顯優(yōu)于阿德福韋酯，但ALT復(fù)常率無明顯差異〔10〕。Reijnders等發(fā)現(xiàn)恩替卡韋對沒有用過核苷類藥物的患者是有效的，應(yīng)答率是79%，對于以前用過阿德福韋酯無論是否發(fā)生耐藥的患者都有效。但是該藥物對于3TC發(fā)生耐藥患者治療后應(yīng)答率低于沒有發(fā)生耐藥人群。常見不良反應(yīng)為頭痛、上呼吸道感染、上腹痛和嘔吐等癥狀〔11〕。④替比夫定(Telbivudine，素比伏)為天然胸腺嘧啶脫氧核苷的自然L型對應(yīng)體，是人工合成的胸腺嘧啶脫氧核苷類抗HBV DNA多聚酶藥物。替比夫定5'-腺苷通過與HBV天然底物胸腺嘧啶的5'-腺苷競爭，從而抑制HBV DNA多聚酶的活性以及通過整合到HBV DNA中造成HBV DNA鏈延長的終止，從而抑制HBV的復(fù)制。替比夫定同時(shí)抑制HBV DNA第一鏈和第二鏈的合成。該化合物在體外可以有效地且有選擇性地抑制人肝腫瘤細(xì)胞株中的HBV。已經(jīng)結(jié)束的多中心、隨機(jī)雙盲的Ⅱb期臨床研究表明，單用Telbivudine或聯(lián)合3TC治療HBV感染的效果明顯優(yōu)于3TC。但是替比夫定治療1年后有5%的患者發(fā)生了HBV突變(rtM204I)〔12〕。

1.2.2 非核苷類似物 非核苷類HBV選擇性抑制劑的研究尚處于起步階段。目前還沒有有效的非核苷類HBV選擇性抑制劑上市。但由于這類化合物活性高，為抗HBV藥物的設(shè)計(jì)提供了很好的依據(jù)。①苯丙氨衍生物:對野生型和3TC耐藥的HBV變種有較好的抑制作用，半數(shù)抑制濃度為2.4 μmol/L。其抗病毒機(jī)制可能是抑制帶有病毒殼體蛋白信息的mRNA的合成〔13〕。②苯并咪唑衍生物:Yun-Fei Li等合成苯并咪唑一系列衍生物，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)12a和12b具有最強(qiáng)抗病毒活性和低毒性。半數(shù)抑制濃度分別為0.9和0.7 μmol/L以及選擇指數(shù)分別為＞1 111和714〔14〕。③雜多化合物:新型多酸化合物具有較好的抗HBV的活性，并且其體外毒性低。對細(xì)胞外HBV DNA的50%抑制濃度(IC50)和90%抑制濃度(IC90)分別為13.42、59.47 mg/L。各濃度實(shí)驗(yàn)組對HBeAg和HBsAg分泌的抑制率均高于對照組阿德福韋酯(P＜0.05)。受試多酸化合物對HepG2.2.15細(xì)胞的50%致死濃度(CC50)值為2 899.21 mg/L〔15〕。新型稀土雜多化合物顯示出很好抗 HBV活性。受試物對HepG 2.2.15細(xì)胞的半數(shù)中毒濃度為1 890.46～1 052.3 μg/ml;對 HBeAg和 HBsAg分泌最高抑制率分別達(dá)90.6%和95.1%;對細(xì)胞外HBV DNA抑制率最高可達(dá)67.68%，優(yōu)于阿德福韋酯等陽性對照藥物〔16〕。體內(nèi)選用鴨乙肝動(dòng)物模型，初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明受試物對DHBV DNA有明顯抑制作用，停藥10 d后血清中HBV DNA含量保持不變。

1.3 中草藥及有效成分 ①苦參素:從中藥苦豆子中提取的氧化苦參堿(Oxymatirne，OM)水溶液，有調(diào)控免疫、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、阻斷肝細(xì)胞凋亡、防止肝纖維化等作用。氧化苦參堿能夠抑制熱應(yīng)激蛋白70(Hsc70)，而Hsc70能夠促進(jìn)HBV DNA復(fù)制。在沒有產(chǎn)生細(xì)胞毒性劑量下氧化苦參堿抑制該蛋白質(zhì)mRNA轉(zhuǎn)錄和HBV DNA復(fù)制分別達(dá)到80%和60%。對HBV DNA抑制機(jī)制是在逆轉(zhuǎn)錄過程。對3TC，阿德福韋酯和恩替卡韋耐藥的HBV病毒有效〔17〕。②葉下珠:研究表明不同葉下珠品種和制劑在體外均有不同程度的抗HBV活性，而未顯示明顯細(xì)胞毒性，相同劑量下，藥物對HBsAg和HBeAg的抑制比HBV DNA抑制效果好，提示藥物對病毒顆粒產(chǎn)生的抑制不僅在轉(zhuǎn)錄前水平，可能對mRNA翻譯水平、蛋白分泌等環(huán)節(jié)也有影響〔18〕。③豬苓多糖:從豬苓的菌核中提取的一種葡聚糖，可增強(qiáng)正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中免疫細(xì)胞的殺傷活性，增強(qiáng)其所誘導(dǎo)的PBMC表達(dá)IL-22受體，并促進(jìn)其分泌IL-22。在HBsAg轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射豬苓多糖，結(jié)果HBV mRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低，HBsAg表達(dá)下調(diào)，表明豬苓多糖對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBsAg的表達(dá)有一定抑制作用。臨床上使用豬苓多糖與乙型肝炎疫苗或 IFN聯(lián)用均取得了很好的療效〔19〕。④MAP30:20世紀(jì)90年代Sylvial Lee-Huang等從苦瓜子中提取的一種植物蛋白，將MAP30作用于HepG2.2.15細(xì)胞，結(jié)果表明MAP30有明顯抗HBV活性，對細(xì)胞外HBV DNA均有抑制作用，也可抑制抗原分泌〔20〕。⑤水芹黃酮(Oenanthe javanica flavone):在HepG2.2.15細(xì)胞系中IC50為2.28 g/L，最大無毒性濃度為1 g/L。在鴨HBV感染模型中，灌胃給藥，1 g/kg濃度劑量給藥，在5和10 d時(shí)對病毒抑制率為54.3%和64.5%。以上均顯示出較強(qiáng)抗病毒活性〔21〕。⑥咖啡鞣酸，奎尼酸和咖啡酸在HepG2.2.15細(xì)胞和鴨HBV模型中都顯示很好抗HBV的活性〔22〕。

2 抗HBV的基因治療

在新型抗HBV治療策略中，基因治療是研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一?；蛑委熂赐ㄟ^對HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)中關(guān)鍵的酶或RNA分子進(jìn)行阻斷來達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的。目前，抗HBV的基因治療技術(shù)主要有DNA疫苗、反義核酸、RNA干擾技術(shù)等。

2.1 DNA疫苗 DNA疫苗是20世紀(jì)90年代開發(fā)出來的。它可以通過特定的基因表達(dá)產(chǎn)物使機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。這種在宿主體內(nèi)表達(dá)抗原的免疫過程與自然免疫相似，可以提呈天然構(gòu)象的HBsAg，無抗原表位的改變;并且具有長期記憶免疫反應(yīng)，不但能用于預(yù)防，且可用于治療。Betancourt等在人類身上試驗(yàn)了HBV DNA疫苗的安全性和免疫原性。證實(shí)該疫苗能被很好耐受，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體〔23〕。

2.2 反義核酸 反義核酸是一種以抑制特定基因表達(dá)為目的基因治療藥物，分為反義核苷酸、核酶和肽核酸〔24〕。①反義寡核苷酸(ASON):ASON依據(jù)堿基配對原則特異地結(jié)合基因組的雙鏈DNA或單鏈mRNA，形成部分雙鏈或三鏈核酸，從而定點(diǎn)封閉靶基因，阻斷特定基因的表達(dá)。RNA-DNA雜交體還可以激活RNAseH使RNA降解，抑制其表達(dá)。②核酶:能特異性結(jié)合并切割病毒RNA而不影響宿主細(xì)胞RNA，即核酶具有反義活性和RNA切割活性雙重作用。由于核酶基因可以通過不同的病毒載體在靶細(xì)胞內(nèi)持續(xù)地表達(dá)，因而克服了直接注射反義DNA所引起的細(xì)胞毒性和被降解等問題。③肽核酸(PNA):PNA于1991年由哥本哈根大學(xué)的Neilsen等首先設(shè)計(jì)合成，是DNA或RNA的類似物。這種經(jīng)過修飾的寡聚核苷酸對DNA或RNA有著高度的親和性和專一性。

2.3 RNA干擾技術(shù)(RNAi)RNAi是一種新型基因阻斷技術(shù)，主要利用雙鏈RNA誘發(fā)對宿主細(xì)胞特異性RNA轉(zhuǎn)錄的抑制，從而抑制特異目的基因表達(dá)。短雙鏈RNA(siRNA)具有其他核酸分子所無法比擬的優(yōu)勢，可能會(huì)成為最有潛力的抗HBV基因治療策略〔25〕。

2.4 其他 He等用美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)抗HBV，體外實(shí)驗(yàn)顯示10 μg/ml PAP明顯抑制 HepG 2.2.15分泌 HBsAg，HBeAg和 HBV DNA，抑制率分別為20.9%，30.2%和50%。同時(shí)把能表達(dá)PAP真核生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)HBV的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2，試驗(yàn)結(jié)果表明對HBV DNA抑制率為74.0%，高于3TC 抑制率63.0%〔26〕。

3 抗HBV的聯(lián)合治療

針對現(xiàn)今抗HBV藥物或手段具有的局限性，越來越多的抗HBV治療研究傾向于將不同作用機(jī)制的藥物或方法聯(lián)合或序貫使用。Johnson〔27〕等對IFNα與3TC可能的相互作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，它們對細(xì)胞系中HBV的復(fù)制過程有顯著的協(xié)同抑制作用，聯(lián)合用藥優(yōu)于單一用藥。IFN加苦參堿治療慢性乙型肝炎能起到互補(bǔ)及協(xié)同作用，對改善自覺癥狀及恢復(fù)肝功能等均有較好療效，且不良反應(yīng)少。3TC與泛昔洛韋聯(lián)合治療慢性乙肝患者，結(jié)果表明，兩者的聯(lián)合治療較3TC單一治療有顯著的優(yōu)越性〔28〕。

4 病毒性肝炎抗病毒治療存在的問題

病毒性肝炎的抗病毒治療，目前存在療效不夠滿意，復(fù)發(fā)率高，有的藥物毒性較大和藥價(jià)昂貴等問題。療效不夠滿意的原因有以下幾個(gè)方面:①目前應(yīng)用的抗HBV藥只能抑制病毒復(fù)制而難以清除病毒。同時(shí)肝炎病毒為細(xì)胞內(nèi)寄生和復(fù)制，抗病毒藥物在細(xì)胞內(nèi)不易達(dá)到有效濃度，因此影響抗病毒效果。肝炎病毒如HBV除在肝細(xì)胞中復(fù)制外，還在其他組織如膽管、胰腺、淋巴細(xì)胞等處復(fù)制?？共《舅幬镙^易清除血中的肝炎病毒，而組織細(xì)胞中的肝炎病毒不易被清除，成為復(fù)發(fā)的重要原因。②HBV DNA在復(fù)制過程中，以cccDNA作為復(fù)制的原始模板，而cccDNA半衰期長，不易自然降解;目前抗病毒藥物尚不能徹底清除cccDNA。一旦停藥后，cccDNA可以作為HBV復(fù)制模板，重新轉(zhuǎn)錄復(fù)制，成為復(fù)發(fā)的重要原因。③肝炎病毒HBV易發(fā)生變異，變異病毒常對抗病毒藥發(fā)生耐藥或療效不好，如HBV前C區(qū)和C區(qū)啟動(dòng)子變異株感染，IFN治療效果差。3TC治療后的YMDD變異株感染，可發(fā)生耐藥等。④CHB患者，常對HBV產(chǎn)生免疫耐受和免疫功能低下，使抗病毒藥治療效果不佳。⑤HBV DNA可與宿主細(xì)胞染色體DNA整合，整合后的HBV DNA不易被抗病毒藥清除。

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