γ-synuclein在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

鄭元元 蔣軍廣 趙 娜 劉瑞芬 楊 超 張婧雯 孫 曼 張曉燕

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450052)

肺癌是威脅人類生命的重大疾病，其發(fā)病率和病死率逐年上升。由人γ突觸核蛋白(γ-synuclein)基因(SNCG)編碼的γ-synuclein為天然無折疊蛋白，是乳腺癌的分子標(biāo)記物，近來研究發(fā)現(xiàn)它在卵巢癌、消化系腫瘤中異常高表達(dá)，在晚期腫瘤中表達(dá)尤其顯著。γ-synuclein的過表達(dá)能夠增加癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力以及對某些化療藥物的耐受性，也使其成為潛在的治療靶點(diǎn)。但國內(nèi)外文獻(xiàn)對于 γ-synuclein在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)及其臨床意義報(bào)道不多。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測γ-synuclein在NSCLC中的表達(dá)，試圖探討NSCLC的發(fā)生、進(jìn)展和侵襲機(jī)制，期望對NSCLC的診斷、治療及預(yù)后評估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)選取60例2006年1月至2008年12月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科手術(shù)摘除的NSCLC病人的標(biāo)本作為觀察組，其中男44例，女16例，年齡36～75〔平均(57.92±17.04)〕歲。所有病人在手術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療。鱗癌34例，腺癌26例;高分化20例，中分化26例，低分化14例。按照美國聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(FIGO)2002年制定的分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期16例，Ⅱ期12例，Ⅲ期21例，Ⅳ期11例。對照組為20例癌旁正常肺組織(距癌組織均＞3 cm)。所有標(biāo)本均為甲醛固定、石蠟包埋組織。兔抗人γ-synuclein多克隆抗體濃縮型(Bioworld Technogy Inc)，生物素-鏈霉菌素-過氧化物酶(S-P)法通用試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購自北京博奧森生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 采用S-P免疫組化法，嚴(yán)格按照S-P試劑盒說明進(jìn)行，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。步驟:石蠟切片脫蠟水化，于枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.1)中行微波抗原修復(fù)，過氧化物酶阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，非免疫性動(dòng)物血清阻斷非特異性反應(yīng)，滴加兔抗人γ-synuclein多克隆抗體，4℃過夜，加生物素標(biāo)記的第二抗體，加鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.2.2 結(jié)果判定 以免疫組化染色后細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)染色的程度分為3級(jí):無著色(1級(jí))評1分，淺黃色(2級(jí))評2分，棕黃色(3級(jí))評3分;高倍鏡(400倍)下每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，每張切片數(shù)5個(gè)視野。按照鏡下陽性細(xì)胞數(shù)占癌細(xì)胞總數(shù)的百分比來綜合判斷，陽性細(xì)胞數(shù)≤25%評為1級(jí)(分)，26% ～75%評為2級(jí)(分)，≥76%評為3級(jí)(分)。最后每張切片的兩次評分的乘積為其最終得分(1～9分)，＞7分的為陽性表達(dá)(+)，＜7分的為陰性表達(dá)(－)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)及四格表資料的精確概率法，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 γ-synuclein在NSCLC組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，γ-synuclein免疫組化陽性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞質(zhì)，也可見定位于細(xì)胞核。60例NSCLC組織中γ-synuclein表達(dá)的陽性率為46.7%(28/60)，20例正常肺組織無1例陽性表達(dá)(0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

2.2 γ-synuclein表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 高中分化的NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達(dá)率為34.8%，低分化為85.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。TNM分期Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達(dá)率為28.6%，Ⅲ、Ⅳ期患者γ-synuclein的陽性表達(dá)率為62.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.009)。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達(dá)率為87.5%，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者為19.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。γ-synuclein的表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的大小、病理類型、臨床分型、有無胸腔積液及是否吸煙無關(guān)(均P＞0.05)。

3 討論

synucleins是小分子可溶性蛋白質(zhì)家族，目前有α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein 3個(gè)成員，主要在神經(jīng)元表達(dá)，在突觸前末梢尤為豐富。目前，對于他們的生物學(xué)功能還沒有充分地了解，已有的研究結(jié)果顯示他們與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及某些神經(jīng)變性疾病有關(guān)。γ-synuclein是該家族的第三個(gè)成員，其表達(dá)組織特異性較高，廣泛表達(dá)于腦組織中，主要位于細(xì)胞質(zhì)和神經(jīng)元的軸突內(nèi)，在乳腺、肝臟、腎臟、肺臟、胸腺、心臟、卵巢、睪丸、前列腺、結(jié)腸和胎盤等組織中表達(dá)量極低或不表達(dá)。近來的研究發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)異常不僅與神經(jīng)退行性病變有關(guān)〔1，2〕，與細(xì)胞惡變也有一定的相關(guān)性。Ji 等〔3〕首先發(fā)現(xiàn)γ-synuclein在乳腺癌組織中高表達(dá)，并且惡性程度越高，其表達(dá)越高。隨后發(fā)現(xiàn)其在胃癌、卵巢癌、肝癌、骨肉瘤、肺癌和前列腺癌等組織中也有異常高表達(dá)。

γ-synuclein有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長分化，增加癌細(xì)胞活動(dòng)，促進(jìn)癌浸潤轉(zhuǎn)移的作用，其機(jī)制可能是:①增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMP)活性。②與微管相關(guān)蛋白 (MAPs)相互作用。③抑制腫瘤生長抑制因子 (OM)。張惠卿等〔4〕的研究結(jié)果顯示:在正常乳腺組織和良性乳腺病變中未見γ-synuclein表達(dá)，在乳腺癌中γ-synuclein陽性率為38.9%，并且γ-synuclein的表達(dá)與TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，在早期 (0/Ⅰ/Ⅱ期)乳腺癌中輕度表達(dá) (10.9%)，在晚期 (Ⅲ/Ⅳ期)乳腺癌中高表達(dá) (80.8%)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)淋巴結(jié)切片鏡檢顯示，種植γ-synuclein陽性的瘤細(xì)胞組，75%存在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，而陰性組只有24%。在遠(yuǎn)處肺轉(zhuǎn)移中，γ-synuclein陽性組也遠(yuǎn)高于陰性組。類似的研究結(jié)果在卵巢癌、胃癌、骨肉瘤、胰腺癌等中均有報(bào)道，但是Zhou等〔5〕的研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中γ-synuclein卻是低表達(dá)的，被認(rèn)為可能是食管癌的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Liu等〔6〕用免疫組化方法，在八種腫瘤 (肝癌、食管癌、前列腺癌、宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌)中檢測γ-synuclein，均呈階段性增高。發(fā)現(xiàn)這種同一種基因在不同細(xì)胞或不同腫瘤組織中的生物學(xué)和生物化學(xué)的功能不同并不意外，因?yàn)槟[瘤的發(fā)展是一個(gè)有關(guān)多基因的復(fù)雜現(xiàn)象，是涉及多步驟的一系列基因事件結(jié)果。國內(nèi)外對γ-synuclein在NSCLC中的報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:20例正常肺組織無1例陽性表達(dá)，60例NSCLC中γ-synuclein陽性表達(dá)率為46.7%;高中分化的NSCLC患者中的γ-synuclein的陽性表達(dá)率為34.8%，低分化為85.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.001)，表明γ-synuclein的表達(dá)與NSCLC的分化程度密切相關(guān)，隨著腫瘤分化程度下降，陽性表達(dá)率升高，推測γ-synuclein的表達(dá)呈惡性生物學(xué)行為;TNM分期Ⅰ、Ⅱ期NSCLC患者中γ-synuclein的陽性表達(dá)率為28.6%，Ⅲ、Ⅳ期患者γ-synuclein的陽性表達(dá)率為62.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.009)，提示γ-synuclein的表達(dá)隨TNM分期進(jìn)展而升高;伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中 γ-synuclein的陽性表達(dá)率為87.5%，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者為19.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.000)，提示γ-synuclein可能與NSCLC的預(yù)后有關(guān)，通過對 γ-synuclein的檢測可以評價(jià) NSCLC的預(yù)后。γ-synuclein的表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的大小、病理類型，臨床分型、有無胸腔積液及是否吸煙無關(guān)。

綜上所述，γ-synuclein的表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但γ-synuclein能否成為NSCLC新的診斷標(biāo)志及判斷其預(yù)后的有效指標(biāo)，還有待進(jìn)一步研究。隨著對γ-synuclein信號(hào)調(diào)控機(jī)制和功能研究的日漸深入，可能為NSCLC的基因治療提供新的靶點(diǎn)和治療措施。

1 Lavedan C，Leroy E，Dehejia A，et al.Identification，localization，and characterzation of the human γ-Synuclein gene〔J〕.Hum Genet，1998;103(1):106-12.

2 Lu A，Gupta A，Li C，et al.Molecular mechanisms for aberrant expression of the human breast cancer specific gene 1in breast cancer cells:control of transcription by DNA methylation and intronic sequences〔J〕.Oncogene，2001;20(17):5173-85.

3 Ji H，Liu YE，Jia T，et al.Identification of a breast cancer-specific gene，BCSGl，by direct differential cDNA sequencing〔J〕.Cancer Res，1997;57(4):759-64.

4 張惠卿，張宇新，張作鳳，等.γ-Synuclein在乳腺癌中的表達(dá)及意義〔J〕. 中國腫瘤臨床，2005;32(1):9-12.

5 Zhou CQ，Liu S，Xue LY，et al.Down-regulation of oc-Synuclein in human esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.World J Gastroenterol，2003;9(9):1900-3.

6 Liu H，Liu W，Wu Y，et al.Loss of epigenetic control of synuclein-gamma gene as a molecular indicator of metastasis in a wide range of human cancers〔J〕.Cancer Res，2005;65(17):7635-43.