飼料中β-興奮劑檢測方法的研究進展

陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 陶亮亮

陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院 寇 慶 梁咪娟

俗稱的“瘦肉精”實際上就是β-腎上腺素興奮劑，簡稱 β-興奮劑（β-agonist）或 β-激動劑（湛嘉等，2009；Martin，2002），主要包含 7 種物質(zhì)：鹽酸克倫特羅（傳統(tǒng)瘦肉精）、萊克多巴胺、沙丁胺醇、硫酸特布他林、硫酸沙丁胺醇、西巴特羅、鹽酸多巴胺。在飼料中添加β-興奮劑能使禽畜肌肉比例提高，增大禽畜的瘦肉率，因此β-興奮劑一度被用于畜牧生產(chǎn)（Cheng 等，2009；李杰，2003；楊志凌和林映才，2003）。然而β-興奮劑在內(nèi)臟中積累較嚴(yán)重，并可通過食物鏈進入人體，嚴(yán)重危害身體健康（賈強等，2005；Adrin 等，2005；尹靖東等，1998）。以往國家執(zhí)法人員多檢測鹽酸克倫特羅，近年來萊克多巴胺也被列入檢測范圍，其余5種則極少被檢測。目前對β-腎上腺素興奮劑的檢測方法主要分5大類：簡易檢驗法、色譜技術(shù)、免疫分析、生物傳感器法和生物芯片法，本文主要這幾種檢測方法進行介紹。

1 簡易檢驗法

對于養(yǎng)殖場或者屠宰場在屠宰前的生豬，可以通過外表觀察進行初步判斷，一般食用 “瘦肉精”的生豬皮毛光亮，后臀結(jié)實、突出且外形飽滿，呼吸頻率加快，四肢不同程度的顫抖，嚴(yán)重者臥地不起，通過這些表現(xiàn)在生豬屠宰前即可做出初步的判斷。對于屠宰后的生豬也可做宰后簡易檢驗，首先從感官進行判斷，喂食 “瘦肉精”后的豬肉顏色鮮艷并且較深，纖維比較疏松，脂肪層薄，瘦肉與脂肪間或有黃色液體流出，后肢與腹部之間的脂肪層內(nèi)分布較密集的毛細血管，顏色深的部位呈現(xiàn)出充血狀態(tài)。也可通過酸堿試紙檢測，正常肉類多呈中性或弱堿性，而喂食“瘦肉精”的肉類偏酸性。

2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）在測定一些對熱不穩(wěn)定和強極性的β-興奮劑類物質(zhì)方面顯示出較好的效果，目前的趨勢是將HPLC和質(zhì)譜（MS）系統(tǒng)聯(lián)用，以實現(xiàn)分析過程的自動化。HPLC法采用高壓泵和高效固定相結(jié)合的高靈敏度的紫外檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器。應(yīng)用HPLC法檢測鹽酸克倫特羅時無需衍生過程，利用β-興奮劑分子能夠與固定相C8或C18分子相互作用，結(jié)合反相柱即可檢測出β-興奮劑類物質(zhì)。正是因為HPLC法具有專屬性好、選擇性強、檢測精確度較高，而且假陽性率低等優(yōu)點，我國目前已將HPLC法作為檢測鹽酸克倫特羅的半確證性方法，此法目前的最低檢測范圍為1～15 ng/g。但是HPLC法在實際應(yīng)用中受到一定的限制，主要是因為此法所需的樣品處理時間長、檢測過程繁瑣、要求專門的技術(shù)人員進行操作等問題 （苗虹等，2010；安洪澤等，2008）。

3 氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）把色譜的高效快速分離能力與質(zhì)譜高靈敏度的定性分析能力相結(jié)合，因此其既適合單組分測定，也適合在多組分同時存在的情況下對某種特定的組分進行定性或定量分析，是非常有效、準(zhǔn)確而又靈敏的方法（孔瑩等，2006； 吳平谷和虞曉珍，2005；Jose 等，2005）。Batioens等（1996）用 GC-MS-MS 法對豬、牛和羊的肌肉、肝臟等組織中殘留的“瘦肉精”進行檢測，結(jié)果顯示最低檢測標(biāo)準(zhǔn)為2 ng/g；Fente等（1999）使用GC-MS法對牛毛中殘留的“瘦肉精”進行檢測，結(jié)果顯示最低檢測標(biāo)準(zhǔn)為5 ng/g；另外，GCMS法與HPLC法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低。Biancotto等（1999）通過對鹽酸克倫特羅分子中的羥基進行硅烷化衍生，然后GC-MS方法檢測最低檢測標(biāo)準(zhǔn)為0.12 ng/mL。Abukhalaf等（2000）用GC-MS分別在尿液及血液中的最低檢測標(biāo)準(zhǔn)分別為0.15 ng/mL和0.12 ng/mL。

4 毛細管區(qū)帶電泳法

當(dāng)傳統(tǒng)的液相色譜法分離的離子化樣品的分離與分析出現(xiàn)困難時，毛細管區(qū)帶電泳法（CE）的優(yōu)越性就顯示出來了，CE法適用于那些其分離效率可達幾百萬理論板塔數(shù)的檢測任務(wù)。Gausepohl等（1998）應(yīng)用CE技術(shù)檢測人尿中鹽酸克倫特羅的殘留，使用pH 3.3的磷酸鹽緩沖液，最低檢測限達到0.5 ng/mL，而且精確度和準(zhǔn)確度均已符合生物樣品中殘留物的檢測標(biāo)準(zhǔn)。王偉宇等（2008）采用小型化毛細管電泳-電化學(xué)檢測技術(shù)測定了豬尿和豬飼料中的克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇， 檢測限為1.20×10-7～ 2.06×10-7g/mL，進一步證實了CE法簡單且有效。CE法的主要優(yōu)點是靈活性大，操作簡單、重復(fù)性強、精度高，所需樣品量少，并且CE法對檢測中所需的緩沖液的組成和pH值、檢測用毛細管的種類和型號、以及檢測中的電場波形等都可以調(diào)節(jié)，這些可調(diào)節(jié)的參數(shù)大大拓展了CE法的應(yīng)用范圍。但是，目前CE法在分析樣品過程中同樣也存著一些亟待解決的問題，檢測時間長和缺乏合適的檢測器是制約該法應(yīng)用的主要瓶頸，但不可否認的是隨著這些困難的克服，CE法將會具有更高的研究價值和應(yīng)用前景。

5 酶聯(lián)免疫吸附法

目前，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）被認為是檢測鹽酸克倫特羅較高效的免疫分析方法。ELISA法的原理是利用抗原和抗體特異性結(jié)合和酶的高效催化作用，將辣根過氧化物酶與克倫特羅結(jié)合，形成酶與偶聯(lián)克倫特羅的復(fù)合物。將包被的抗體固定于載體上，使其與特異性的抗克倫特羅抗體結(jié)合，將酶偶聯(lián)克倫特羅和待測克倫特羅同時加入，二者會與克倫特羅抗體發(fā)生競爭性結(jié)合，經(jīng)過洗滌后加入底物，經(jīng)充分反應(yīng)后，可依據(jù)有色物的顏色變化程度來對待測克倫特羅進行計量。如果兩者中待測克倫特羅數(shù)量多，那么被結(jié)合的酶偶聯(lián)克倫特羅數(shù)量則少，這樣有色物的量就少，最后可用比色法測定樣品中的克倫特羅含量（高彬文等，2009；胥傳來等，2005）。我國在使用ELISA法檢測鹽酸克倫特羅方面的研究起步較晚，但近幾年發(fā)展較快，目前采用單克隆抗體技術(shù)已成功開發(fā)出檢測試劑盒，在特異性方面與國外同類產(chǎn)品相當(dāng)，并且檢測靈敏度可達到農(nóng)業(yè)部監(jiān)督檢測標(biāo)準(zhǔn)值0.5×10-9的要求。

6 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器（BS）是近年來發(fā)展起來的一種可以用于分析檢測β-激動劑類物質(zhì)的高效的新型設(shè)備。BS是由生物活性物質(zhì)作為敏感元件再結(jié)合適當(dāng)?shù)膿Q能器及輸出顯示裝置所構(gòu)成的分析工具。BS法的原理是當(dāng)傳感器的分子識別部分與被識別物質(zhì)相接觸后，通過引發(fā)化學(xué)變化、光變化和熱變化，來直接誘導(dǎo)產(chǎn)生電信號，進一步利用電學(xué)測量方法進行檢測、控制和輸出結(jié)果的方法。1967年Updike等制出了第一個生物傳感器用于檢測葡萄糖。Traynor等（2003）采用表面等離子體共振生物傳感器對肝臟組織的β-激動劑類物質(zhì)進行的檢測取得了令人滿意的效果。未來的生物傳感器需要與計算機緊密結(jié)合，能夠自動采集和處理數(shù)據(jù)，更加科學(xué)準(zhǔn)確地呈現(xiàn)數(shù)據(jù)，實現(xiàn)采樣、進樣、顯示、分析等的自動化，同時，芯片技術(shù)將整合進傳感器，以實現(xiàn)檢測系統(tǒng)的集成化。

7 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)（biochip）是生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速崛起的一項高新技術(shù)，是在玻璃片、硅片等材料上固定樣本，通過微加工技術(shù)以實現(xiàn)對核酸、蛋白質(zhì)、化合物等準(zhǔn)確、快速、高通量的檢測（Wang等，2006；Walsh 和 Chang，2004）。 與傳統(tǒng)的檢測方法相比，生物芯片的突出優(yōu)點是能夠在短時間內(nèi)分析大量的被檢分子，如飼料中違規(guī)添加劑和獸藥殘留的檢測、微生物的檢測和動植基因突變的檢測等（Bertram等，2004）。目前的獸藥殘留蛋白質(zhì)免疫芯片檢測系統(tǒng)，能夠在幾分鐘內(nèi)檢測出飼料、肉品、乳品中的添加劑殘留量。飼料或肉類中的違規(guī)添加劑一般是小分子化學(xué)物質(zhì)，檢測時可用快速提取儀進行提取，與抗體混合放置芯片上，通過抗原抗體發(fā)生競爭性免疫反應(yīng)，再經(jīng)激光共聚焦掃描儀掃描，最后通過計算機自動判斷是否超標(biāo)（Wang 等，2006；Walsh 等 2004）。 目前此生物芯片系統(tǒng)可對包括β-激動劑、鏈霉素、磺胺二甲嘧啶等進行檢測。

8 小結(jié)

目前，HPLC、GC-MS、CE 方法對 β-興奮劑的最低檢測限均在0.5 ng/g左右，并且檢測過程耗時長，必須要由專業(yè)人員來操作，所用的儀器價格昂貴，而且不能進行現(xiàn)場檢測。而免疫學(xué)法中的ELISA法的最低檢測限為0.05 ng/g，靈敏度和精確度都符合農(nóng)業(yè)部的標(biāo)準(zhǔn)，但假陽性率高是一直未能解決的難題，而且ELISA法也不能進行現(xiàn)場檢測。因此，如果能找到一種檢測耗時短、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、自動化水平很高、無需專業(yè)人員操作的檢測方法將具有非常廣闊的應(yīng)用前景，預(yù)計未來幾年開發(fā)這種檢測方法的研究必將成為熱點。

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