地方豬種冷凍精液在遺傳資源保護(hù)中的利用前景

文│朱芳賢（全國畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院）

劉丑生 趙俊金（全國畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心）

凍精保種對我國地方豬種資源保護(hù)，乃至豬聯(lián)合育種工作將具有積極的社會意義和經(jīng)濟(jì)意義，希望各相關(guān)科研單位能夠加大對這方面技術(shù)的研發(fā)與改進(jìn)力度，以便能很好地適應(yīng)現(xiàn)階段養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展進(jìn)程，充分發(fā)揮優(yōu)良地方豬種優(yōu)良基因的作用。

近來豬種資源數(shù)量持續(xù)下降，甚至有加劇的趨勢。表現(xiàn)在：一是資源數(shù)量減少，據(jù)《中國畜禽遺傳資源狀況》（2004年）統(tǒng)計，全國有40%以上的地方豬品種群體數(shù)量有不同程度的下降，相繼有14個地方豬品種被確定為瀕危資源，有5個品種被確定為瀕臨滅絕資源，深縣豬、項城豬、豪桿嘴型內(nèi)江豬、大普吉豬等4個品種（類群）已滅絕；同時，品種內(nèi)遺傳多樣性豐富度降低，許多地方品種（類群）的母豬數(shù)量急劇下降，公豬頭數(shù)與血統(tǒng)數(shù)銳減，品種內(nèi)的遺傳多樣性日益縮小，遺傳變異日益枯竭，遺傳基礎(chǔ)愈來愈狹窄。

豬冷凍精液是遺傳資源保護(hù)及育種的一種有效手段，然而目前養(yǎng)豬業(yè)中限制冷凍精液應(yīng)用的因素很多，公認(rèn)的主要原因有冷凍精液的受精率比新鮮精液低，不同公豬精液冷凍效果的差異大，每一次輸精需要大量精子以及生產(chǎn)成本高等。其他因素有缺乏可靠的評定精液品質(zhì)的實驗室方法，難于掌握適時輸精、精液冷凍和解凍的方法復(fù)雜，以及豬場不易得到液氮供應(yīng)等。

雖然豬冷凍精液解凍后活力和受精能力在短時間內(nèi)不可能有大的提升，但隨著畜牧科技人員掌握凍精最佳輸精時間技術(shù)的提高，相關(guān)設(shè)備的投入與改進(jìn)，繁殖新技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用，以及輸精劑量和次數(shù)的增加，凍精的受胎率可達(dá)到理想的水平，從而使得目前看來受胎率不理想的豬冷凍精液在將來的遺傳資源保護(hù)利用中有好的應(yīng)用前景。

一、掌握適時授精時間提高母豬分娩率的可能性

隨著畜牧科技人員對凍精最佳輸精時間了解程度的提高，在使用凍精配種過程中可根據(jù)不同品種、不同胎次、不同年齡的母豬發(fā)情期長短作好發(fā)情鑒定；從母豬陰戶紅腫程度、顏色和干濕度黏液透明度和顏色，用手掌按壓母豬臀部甚至騎在背部等方法來確定凍精最佳輸精時間，從而提高凍精配種受胎率。

應(yīng)用B超準(zhǔn)確地鑒定母豬卵泡發(fā)育，掌握適時授精是提高凍精配種受胎率極其重要的措施。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，B超在獸醫(yī)疾病診斷、人工授精、胚胎移植中鑒定卵泡發(fā)育和早期妊娠檢測均有快速、準(zhǔn)確和精確的特點(diǎn)，B超和腹腔鏡將成為未來人工授精中必備的工具。隨著相關(guān)儀器價格的下降，國外一些先進(jìn)企業(yè)在種豬繁殖育種過程中利用B超和腹腔鏡的越來越多，相信國內(nèi)對其應(yīng)用也將越來越多。

Waberski等1994年的實驗證明了對最佳授精時間的選擇是提高母豬分娩率的關(guān)鍵因素之一，其實驗結(jié)果為：授精時間在預(yù)計排卵前8小時以上時，受胎率為0%（0/16）；排卵前8～4小時，授精分娩率為70%（104/145）；排卵前4小時，授精母豬受胎率為100%、分娩率為88.1%；排卵后4小時內(nèi)，授精受胎率為68.5%、分娩率為50%。Bolarin等（2006）研究了407頭自發(fā)排卵母豬，每次授精只使用含10億精子的冷凍精液，在接近排卵時間（超聲波檢查）時采取子宮深部授精，獲得超過80%的產(chǎn)仔率和10頭以上胎產(chǎn)仔數(shù)，也證實了準(zhǔn)確確定發(fā)情排卵時間在授精中的重要性。

二、子宮深部授精方式的發(fā)展和運(yùn)用

到目前為止，豬人工授精一般都是應(yīng)用一次性海綿頭的輸精管在子宮頸深部授精。子宮頸內(nèi)授精會有大量的精子（約25億）輸進(jìn)子宮頸后部的皺褶，大多數(shù)的母豬在輸精時和之后會表現(xiàn)出精液逆流現(xiàn)象，因而，大約30%～40%輸入子宮頸管的精子，會在授精后1小時內(nèi)從管中流出。同時，超過90%的精子在授精后2～3小時內(nèi)被母豬的生殖系統(tǒng)——子宮頸、子宮、子宮輸卵管連接部、輸卵管壺峽連接部篩選排斥。這種精子的大量流失限制了能夠到達(dá)子宮輸卵管連接處的精子數(shù)。向成年母豬授精30億冷藏精子，只有大約10萬成功的達(dá)到了子宮輸卵管連接處，大約1000個精子達(dá)到了輸卵管峽部的精子儲存庫。此外，在精子質(zhì)量差時這種損失更為嚴(yán)重，比如解凍后的精子。實際上，在輸卵管中凍精的有效精子數(shù)一般比冷藏的低十倍。

隨著輸精技術(shù)的改進(jìn)——輸精器改進(jìn)和手術(shù)、腹腔鏡法等新的子宮角輸精法（deep uterineinsemination，DUI）的采用，將精液輸?shù)阶訉m頸后更深部位能夠使更多的精子到達(dá)子宮輸卵管連接部。與常規(guī)的子宮頸內(nèi)授精相比，子宮深部授精方式可以減少每次輸入的冷藏精子數(shù)目。要達(dá)到子宮頸內(nèi)授精（每次30億以上精子）的受精效果，可以期待由每次輸精1億～1.5億（子宮深部授精）得到。因此，這種方式被視為接近在生產(chǎn)條件下使用冷凍精液的實用、有效授精方式。特別是在精液有限，高質(zhì)量的種公豬的精液需要得到盡可能有效的使用，或者保種需要的情況下。

1.輸精器改進(jìn)。Martinez 等（2001）采用一種柔性光纖內(nèi)窺鏡（長度：1.35米；外直徑：3.3毫米；內(nèi)直徑：1.2毫米）實現(xiàn)了子宮角輸精。這種輸精裝置插入到子宮角只需4.1±0.26分鐘，應(yīng)用這種子宮角輸精法，輸精效果（鮮精，每次10億、2億、0.5億）與常規(guī)輸精法（鮮精，每次30億）在產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)上差異不顯著；Rocaetal等（2003）采用激素誘導(dǎo)，一次子宮角輸精使冷凍精液的輸精量降為10億/次，產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)分別達(dá)到77.55%，9.31頭；Bolar′netal等（2006）對自然發(fā)情母豬進(jìn)行2次子宮角輸精（10億/次），產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)也分別達(dá)到70.1%，9.18頭；法國卡蘇公司等在使用冷凍精液授精時改進(jìn)了授精管，在海綿頭授精管的內(nèi)部設(shè)置一條細(xì)的導(dǎo)管，當(dāng)授精管插入子宮頸深部后再推進(jìn)內(nèi)置的細(xì)導(dǎo)管，直到子宮角的彎曲部，這樣精液能直接輸入子宮內(nèi)或子宮角，使用這種方法，據(jù)研究，用有授精能力的5億～6億精子和平常使用30億精子無顯著差異；Vazquez等（2001）在西班牙對329只經(jīng)產(chǎn)母豬使用子宮深部授精（1.5億冷藏精子/次）1次、2次或3次以及子宮頸內(nèi)授精（30億冷藏精子/次），產(chǎn)仔率為83.3%～87.3%，胎產(chǎn)仔數(shù)在9.2～10.4個；Day等（2003）在美國對105只經(jīng)產(chǎn)母豬分別采用2次子宮深部授精1.5億冷藏精子或者子宮頸內(nèi)授精30億冷藏精子，產(chǎn)仔率分別為83%、90%，二者沒有顯著差異。

2.外科手術(shù)植入。最近的研究顯示，最少1000萬冷藏精子通過外科手術(shù)植入子宮輸卵管結(jié)合部，受孕率高達(dá)89%。

3.腹腔鏡法。比起剖腹手術(shù)把精液直接輸入子宮，腹腔鏡法是一種創(chuàng)傷較小的手術(shù)，并且是可在大的養(yǎng)殖場中培訓(xùn)推廣的技術(shù)。意大利完成的一項試驗中，F(xiàn)antinati等（2005）通過腹腔鏡把精子輸入接近子宮輸卵管連接處，達(dá)到高受胎率所需的冷藏精子數(shù)量可以減少至每個子宮角500萬個精子，這種腹腔鏡技術(shù)已經(jīng)被證明可用于受胎率更低的性控精液輸精。最近還有報道稱，使用腹腔鏡法每個子宮角輸入30萬個性別分離精子，受孕率可達(dá)80%。

三、繁殖新技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用

隨著激素調(diào)控敏化子宮、單精子顯微注射和克隆技術(shù)等繁殖新技術(shù)的發(fā)展和運(yùn)用，豬的凍精有了更加廣闊的利用前景，尤其是活體滅絕豬種的凍精更有價值。

1.敏化子宮。用激素讓子宮變得敏感，提高受胎率的方法目前在養(yǎng)豬生產(chǎn)中有應(yīng)用，比如在每份精液中加入催產(chǎn)素、前列腺素；一些試驗在輸精前加入人工合成的精漿制品；用不育的公豬與小母豬交配；用死精給小母豬輸精等，目的都是試驗激素對子宮的影響程度。施學(xué)仕（2007）在每份精液中加入律胎素（PGF2a）0.5～1.0毫升，1557頭母豬產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)分別達(dá)到83.80%，10.15頭，未添加者（1552頭）產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)為86.80%，10.28頭；精液中加入合成精漿MR-A Predil，296頭母豬產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)分別達(dá)到83.80%，10.15頭，未添加者（324頭）產(chǎn)仔率與平均窩產(chǎn)仔數(shù)為82.07%，10.04頭；據(jù)嚴(yán)家清（2001）介紹，在冷凍精液解凍后添加PGF2a，并且授精時間適宜，母豬的分娩率在80%～100% ，窩產(chǎn)仔數(shù)平均為8.1～11.7頭。原因是精液經(jīng)冷凍保存后，精子壽命縮短，若過早或過遲到達(dá)受精部位，均會失去受精的機(jī)會。由精液成分分析得知，鮮精內(nèi)PGF2a的含量在200微克/升左右，冷凍后大部分被破壞，不能刺激母豬子宮和輸卵管的蠕動，精子不能在正常的時間內(nèi)游動到受精部位。

2.單精子顯微注射。單精子顯微注射是新興助孕技術(shù)，出現(xiàn)于1992年，即在體外用機(jī)械注射方法將單個精子注入到卵子的胞質(zhì)內(nèi)，卵裂達(dá)一定程度時移回宮腔。

3.克隆技術(shù)。自從1997年Dolly羊誕生，克隆技術(shù)在整個生物界成為熱點(diǎn)，2000年“陽陽”的問世，彌補(bǔ)了我國山羊克隆技術(shù)的又一空白。無論是胚胎克隆，還是體細(xì)胞克隆，都能發(fā)育為一個正常的個體。利用此技術(shù)，只要有瀕危物種的胚胎細(xì)胞或者體細(xì)胞，那么都有可能使其生長為一個正常的個體。據(jù)2002年新加坡的一位學(xué)者報道，他領(lǐng)導(dǎo)的研究小組從已經(jīng)滅絕10多年的Gaur calf標(biāo)本的皮膚組織中，利用體細(xì)胞克隆技術(shù)克隆出了一只Gaur calf，使這一物種重新回到了生物界。這提示人們，某些已經(jīng)滅絕的物種仍有可能會幸運(yùn)地獲得新生，給動物遺傳資源的保護(hù)工作提供了一條新途徑。

四、增加輸精劑量和次數(shù)以提高豬凍精受胎率的效果

1.增加輸精劑量。Waston & Behan（2002）在英國每次使用10億精子通過子宮頸后授精技術(shù)給3240只經(jīng)產(chǎn)母豬輸精，產(chǎn)仔率為88.7%，胎仔數(shù)為12.1只，與子宮頸內(nèi)授精的產(chǎn)仔率91.3%，胎仔數(shù)12.5個相比無顯著差異。然而，Roberts & Bilkei（2005）在匈牙利和克羅地亞對1783只經(jīng)產(chǎn)母豬分別使用10億精子子宮頸后授精和30億精子子宮頸內(nèi)授精，盡管兩者在產(chǎn)仔率上相似，但子宮頸后授精的母豬胎產(chǎn)數(shù)卻明顯少（前者10.2只，后者12.3只），這些結(jié)果與Rozeboom等（2004）于美國研究報道一致。當(dāng)嘗試更少輸精數(shù)量時，即每次輸精5億精子，產(chǎn)仔率和胎仔數(shù)降低。說明凍精輸精受胎率與輸精劑量呈正相關(guān)。

2.增加輸精次數(shù)。Reed等在1984年報告凍精輸精受胎率與每個情期的輸精次數(shù)也呈正相關(guān)。

五、結(jié)論

凍精保種對我國地方豬種資源保護(hù)，乃至豬聯(lián)合育種工作具有積極的社會意義和經(jīng)濟(jì)意義。就現(xiàn)在很多地方豬種種群個體數(shù)量銳減，一些豬種滅絕，一些豬種面臨滅絕的現(xiàn)狀而言，希望各相關(guān)科研單位能夠加大在這方面技術(shù)的研發(fā)與改進(jìn)力度，以便能很好地適應(yīng)現(xiàn)階段養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展進(jìn)程，充分發(fā)揮優(yōu)良地方豬種優(yōu)良基因的作用。各級部門應(yīng)制作并保存地方豬種凍精，進(jìn)行保種工作宜早不宜遲。