補(bǔ)腎醒腦方對(duì)大鼠血管性癡呆機(jī)制分析

楊春壯，馬英，李明秋，王媛媛，趙冰，田軼群

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江省高校腫瘤疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011)

血管性癡呆(Vascular Dementia VD)是一系列腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害而產(chǎn)生的癡呆癥狀的總稱，是老年癡呆的主要類型之一。隨著全球人口老齡化的發(fā)展，VD發(fā)病率逐年上升［1］，已經(jīng)成為老年人群的常見病、多發(fā)病，患者主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力受損，嚴(yán)重影響日常生活，給家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。因此，改善患者的學(xué)習(xí)記憶能力是治療VD的重要方面之一。補(bǔ)腎醒腦方可益氣補(bǔ)腎、祛瘀化痰、醒腦益智，對(duì)于VD的治療有顯著的療效，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討補(bǔ)腎醒腦方的獲效機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 ZH－200型大鼠光電刺激跳臺(tái)(安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);Multiskan MK3酶標(biāo)儀(Thermo熱電上海儀器有限公司);大鼠AchE酶聯(lián)免疫試劑盒(上海勁馬生物科技有限公司);KWD－808Ⅱ型電針儀(上海醫(yī)療儀器廠)。

1.2 主要藥品及配制 補(bǔ)腎醒腦方:人參9g，熟地黃12g，女貞子 12g，制首烏 12g，丹參 9g，川芎 9g，赤芍9g，菖蒲6g，遠(yuǎn)志6g，天麻6g，冰片2g組成。采用水提法，提取物，濃度為0.2g/mL。

1.3 血管性癡呆大鼠模型的制作 健康Wistar大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量(200～350)g［由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(黑)2008004］。以10%水合氯醛按400mg/kg腹腔注射麻醉，75%酒精消毒頸部皮膚，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，穿線備用。硝普鈉按3.5mg/kg腹腔注射造成低血壓。立即關(guān)閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10min，再通10min，如此反復(fù)3次，撤線，縫合，放回籠中飼養(yǎng)。于造模后第5天測試學(xué)習(xí)成績，24h重復(fù)測試，作為判斷動(dòng)物記憶成績的指標(biāo)，檢驗(yàn)造模是否成功。將造模成功的大鼠45只，隨機(jī)分為電針組15只，針灸組15只，模型組15只，正常對(duì)照組全部存活。

1.4 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)方法

跳臺(tái)裝置為60cm×12cm×33cm的被動(dòng)回避反應(yīng)箱。為便于觀察，三面用黑色塑料板分隔，一面為透明塑料絕緣板，箱底為可通電的銅柵，反應(yīng)箱的右后角均放置一直徑和高為4.5cm的絕緣橡皮墊，作為大鼠回避電擊的安全臺(tái)。由一調(diào)壓器(帶有開關(guān))調(diào)節(jié)電壓，提供交流電。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠放入此裝置中適應(yīng)3min，然后通以40v交流電，動(dòng)物受電擊后，其正常反應(yīng)是跳到安全臺(tái)躲避電擊，操作人員記錄通電后其跳到安全臺(tái)上的時(shí)間，作為反應(yīng)期，以反應(yīng)期作為其學(xué)習(xí)成績。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1 動(dòng)物分組 將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組、針灸組和對(duì)照組，每組各15只。

1.5.2 治療方法

電針組:采用30號(hào)1寸毫針，選取大鼠百會(huì)、大椎、人中3個(gè)穴位，捻入0.5寸，用KWD－808Ⅱ型電針儀，刺激參數(shù):疏密波，頻率10Hz，電壓1.5V，留針10min，持續(xù)電刺激，每日1次，連續(xù)30天。

中藥組:補(bǔ)腎醒腦方灌胃，每只2g/kg/d。

模型組:純凈水灌胃，2g/kg/d。連續(xù)30天。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)方法 治療30天后，隔日測試學(xué)習(xí)成績，24h重復(fù)測試，作為判斷動(dòng)物記憶成績的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠放入跳臺(tái)裝置內(nèi)蓋上黑色絕緣蓋以防止其竄出，適應(yīng)3min后，通入40V交流電，大鼠的正常反映是跳上跳臺(tái)，操作人員記錄其跳上跳臺(tái)的時(shí)間，并作為它的反應(yīng)期。

1.5.4 酶指標(biāo)實(shí)驗(yàn) 跳臺(tái)測試完畢后大鼠禁食過夜。次日尾靜脈取血樣。2 000r/min離心20min，分離血清取完血后，將大鼠斷頭后快速取出全腦，置于冰盒上，分離海馬并稱重，按1∶9的比例加入生理鹽水勻漿，將勻漿液置于離心機(jī)2 000r/min離心20min，取上清液測AchE。

2 結(jié)果

2.1 治療后各組大鼠學(xué)習(xí)成績的比較 結(jié)果見表1。

表1 治療后各組大鼠學(xué)習(xí)成績的比較(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05。

反應(yīng)期正常組組別 n 15 6.76 ±11.65 15 4.65 ±9.71模型組 15 11.68 ±12.96△中藥組 15 6.99 ±6.93*西藥組

2.2 治療后各組大鼠血和海馬AchE含量的吸光度比較 結(jié)果見表2。

表2 治療后各組大鼠血和海馬AchE含量的吸光度比較(±s，n=15)

注:與模型組比較，*P＜0.05;與正常組比較，△P＜0.05。

組別 血清 海馬正常組0.5875 ±0.1270 0.5640 ±0.0832模型組 1.0155±0.1924△ 0.9042±0.2404△中藥組 0.8204 ±0.1018* 0.5707 ±0.0272*西藥組 0.8162 ±0.1153 0.5998 ±0.05181)

3 討論

大腦反復(fù)缺血再灌注是造成VD的主要原因之一。老年癡呆癥、高血壓病是以動(dòng)脈粥樣硬化為病理基礎(chǔ)的心身疾病，是腦血管性癡呆的重要致病因素。老年癡呆癥應(yīng)從心腦腎論治，臨床重在補(bǔ)腎養(yǎng)心，化瘀軟堅(jiān)，調(diào)節(jié)情志。實(shí)驗(yàn)表明，損毀雙側(cè)海馬嚴(yán)重影響大鼠空間作業(yè)的認(rèn)知能力［2］，并可導(dǎo)致跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)重障礙。立足于中醫(yī)基礎(chǔ)理論，運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)揭示中醫(yī)藥治療VD的作用機(jī)制，使中醫(yī)藥治療VD可能成為一條有效的途徑［3］。補(bǔ)腎醒腦方可化痰瘀通心竅，軟化血管，改善血流動(dòng)力學(xué)，從而有效降低高血壓對(duì)靶器官(心腦腎)的損害，改善大腦功能，延緩大腦組織萎縮，防止癡呆癥發(fā)生。改善氣血循環(huán)，學(xué)習(xí)記憶力得到一定恢復(fù)。海馬是對(duì)腦缺血最敏感的部位之一，腦缺血再灌注后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性壞死［4］。本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈線結(jié)法造成大鼠腦組織反復(fù)缺血－再灌注損傷，經(jīng)行為學(xué)測試證明存在學(xué)習(xí)、記憶障礙，是較為理想的VD模型，補(bǔ)腎醒腦方治療組學(xué)習(xí)記憶能力與模型組比較有顯著差異(P＜0.05)，提示此方能改善VD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

海馬(hippocampalformation)是大腦的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，在學(xué)習(xí)和記憶功能中起著非常重要的作用，同時(shí)，也是大腦具有可塑性和極易受損的一個(gè)腦區(qū)，對(duì)缺血缺氧極為敏感。已有證據(jù)表明，海馬結(jié)構(gòu)參與學(xué)習(xí)和記憶的形成，與膽堿能系統(tǒng)密切相關(guān)，此系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)Ach分布與含量的改變?cè)诎V呆進(jìn)展中發(fā)揮著非常重要的作用。

國內(nèi)外普遍認(rèn)為，中樞膽堿能系統(tǒng)在VD患者認(rèn)知功能中具有重要作用，額葉皮層及海馬膽堿能神經(jīng)元的損傷可能是其認(rèn)知功能受損的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，在腦缺血－再灌流的過程中，神經(jīng)遞質(zhì)尤其是ACh含量的變化可促進(jìn)腦損傷的發(fā)生。有研究認(rèn)為［5］，腦缺血－再灌流后興奮性氨基酸大量釋放，作用于突觸后神經(jīng)元，產(chǎn)生“興奮性神經(jīng)毒”作用，導(dǎo)致突觸后神經(jīng)元的損害。某些膽堿酯酶抑制劑和擬膽堿能制劑對(duì)神經(jīng)元也有損害作用 。AChE特異性較高，可在膽堿能神經(jīng)末梢、效應(yīng)器接頭或突觸間隙等部位終止ACh作用，使其水解［6］，其活性變化可間接反映腦內(nèi)ACh的代謝情況。

綜上所述，中醫(yī)藥治療VD具有一定優(yōu)勢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠海馬及血內(nèi)AChE活性明顯高于正常組，提示腦缺血時(shí)膽堿能神經(jīng)元改變，使AChE釋出，組織中AChE活性升高，導(dǎo)致ACh水平進(jìn)一步降低，加重大的學(xué)習(xí)記憶功能的改變。經(jīng)過補(bǔ)腎醒腦方治療后的大鼠與其他組比較可見，血管性癡呆大鼠腦和血內(nèi)AChE活性明顯降低，膽堿能系統(tǒng)的功能加強(qiáng)，調(diào)節(jié)ACh生理代謝，使大鼠的學(xué)習(xí)和記憶等的能力得到顯著提高，使VD得以治療。

［1］ 賈建平，江漢秋.進(jìn)一步重視血管性癡呆的防治［J］.內(nèi)科理論與實(shí)踐，2007，2(2):67 －69.

［2］ 隋南，陳雙雙，匡培梓.海馬結(jié)構(gòu)、前額皮層或尾－殼核損毀對(duì)大鼠空間認(rèn)知能力的影響［J］.心理學(xué)報(bào)，1992，24(4):415 －420.

［3］ 李璟怡，黃俊山.血管性癡呆的中西醫(yī)治療進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2006，4(6):519 －520.

［4］ 楊春壯，王瑩，李明秋，等.補(bǔ)腎醒腦方對(duì)擬血管性癡呆大鼠行為學(xué)及組織內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶含量的影響［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，39(4):21－23.

［5］ 戴光明，鄭健，王東武，等.腦缺血 －再灌流后大鼠海馬GABA、Ach水平和遲發(fā)性神經(jīng)元損害關(guān)系的研究［J］.中國病理生理雜志，1994，10(4):434 －436.

［6］ 楊寶峰.藥理學(xué)［M］.7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:64.