用于神經(jīng)突導(dǎo)向研究的螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系初步觀察△

李樹峰 王正敏 李雯

·基礎(chǔ)研究·

用于神經(jīng)突導(dǎo)向研究的螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系初步觀察△

李樹峰 王正敏 李雯＊

目的探尋適用于螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突導(dǎo)向研究的螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系。方法取新生SD大鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)，分別進(jìn)行分離培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)，比較神經(jīng)突的生長模式。組織塊培養(yǎng)時，采用不同底物(包括多聚賴氨酸、層粘連蛋白和I型膠原蛋白等)鋪片，觀察對螺旋神經(jīng)元組織塊貼壁和神經(jīng)突生長的影響。用微管相關(guān)蛋白2(MAP2)抗體和微管聚合蛋白1(Tau-1)抗體鑒別神經(jīng)突的極性。結(jié)果組織塊培養(yǎng)體系中，部分神經(jīng)突長出細(xì)胞毯，在無干擾的環(huán)境中生長。以多聚賴氨酸加層粘連蛋白為底物鋪片時，組織塊貼壁率高，神經(jīng)突數(shù)量多、生長較快，有利于獲取更多適于神經(jīng)突導(dǎo)向研究的神經(jīng)突。培養(yǎng)體系中的神經(jīng)突可被Tau-1抗體標(biāo)記，而不能被MAP2抗體標(biāo)記。結(jié)論在多聚賴氨酸加層粘連蛋白包被的可移動玻片上，進(jìn)行螺旋神經(jīng)元組織塊培養(yǎng)獲取自由神經(jīng)突的方法適合螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突的導(dǎo)向研究。(中國眼耳鼻喉科雜志，2011，11：82-85)

螺旋神經(jīng)元；神經(jīng)突導(dǎo)向；神經(jīng)突；組織塊培養(yǎng)；多聚賴氨酸；層粘連蛋白

螺旋神經(jīng)元是一種將Corti器轉(zhuǎn)換產(chǎn)生的電信號向中樞傳遞的雙極神經(jīng)元，也是人工耳蝸植入后將言語處理器轉(zhuǎn)換編程的電信號向大腦傳遞的關(guān)鍵途徑。重度和極重度感音神經(jīng)性聾往往有原發(fā)或繼發(fā)的螺旋神經(jīng)元退行性變，包括螺旋神經(jīng)元數(shù)量減少及周圍突退縮和減少等[1-3]，從而影響人工耳蝸植入后的效果[4-6]。多種因素可促進(jìn)螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突的再生，然而體內(nèi)實驗研究表明，神經(jīng)突的再生方向是無序的，并非總是朝鼓階和基底膜方向[7]。神經(jīng)突的導(dǎo)向研究不僅需要單離的神經(jīng)突，而且由于神經(jīng)突與導(dǎo)向因子來源之間的方位可以任意調(diào)整，還需有活細(xì)胞長時間觀察和記錄裝置。關(guān)于螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突導(dǎo)向的相關(guān)研究雖有少量報道，然而均沒有建立能滿足上述要求的培養(yǎng)體系[8-11]。為探尋這樣一種培養(yǎng)體系，本研究比較了分離培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)時螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突的不同生長模式，以及不同培養(yǎng)底物對組織塊培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 分別采取組織塊培養(yǎng)和分離培養(yǎng)兩種方法培養(yǎng)螺旋神經(jīng)元，觀察螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突的生長模式；觀察采用不同底物進(jìn)行組織塊培養(yǎng)對組織塊貼壁和神經(jīng)突生長情況的影響。實驗采取成組設(shè)計。

培養(yǎng)玻片的包被：直徑14 mm的圓形玻片經(jīng)酸洗，然后以蒸餾水和無水乙醇先后漂洗，再經(jīng)干熱滅菌后備用。底物包被在超凈臺中進(jìn)行，分為以下5組：①層粘連蛋白組(L組)：20 μg/mL層粘連蛋白(L2020， Sigma-Aldrich，美國)40 μL均勻涂布在每個玻片上，置于37 ℃溫箱中2 h后，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)漂洗3次，然后置超凈臺中晾干備用； ②多聚賴氨酸組(P組)：100 μg/mL多聚賴氨酸(P7405，Sigma-Aldrich，美國)40 μL均勻涂布在每個玻片上，置于4 ℃冰箱中過夜后，用PBS漂洗3次，然后置超凈臺中晾干備用；③多聚賴氨酸加層粘連蛋白組(P+L組)：玻片先用多聚賴氨酸后，用層粘連蛋白按上述方法處理；④I型膠原蛋白組(C組)：300 μg/mL I型膠原蛋白(C3867，Sigma-Aldrich，美國)40 μL均勻涂布在每個玻片上，置于4 ℃冰箱中過夜后，用PBS漂洗3次，然后超凈臺中晾干備用； ⑤I型膠原蛋白加層粘連蛋白組(C+L組)：玻片先用I型膠原蛋白后，用層粘連蛋白按上述方法處理。

1.2 螺旋神經(jīng)節(jié)的解剖 將出生4～6 d的新生SD大鼠斷頭后取出顳骨，置于0～4 ℃的PBS中。打開耳囊，去除血管紋、基底膜、蝸神經(jīng)和蝸軸骨質(zhì)，將剩余的蝸軸剪成300～400 μm的組織塊。

1.3 螺旋神經(jīng)元的培養(yǎng) ①組織塊培養(yǎng)：培養(yǎng)液為DMEM/F12(10565018，Invitrogen，美國)加B27和N2添加劑(17504-044，17502-048，Invitrogen，美國)。將3塊螺旋神經(jīng)節(jié)組織塊分別移放于培養(yǎng)皿中的玻片上，加入培養(yǎng)液至剛沒過組織塊，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待其貼壁后再添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。上述不同培養(yǎng)底物組中，每組10個玻片，每片3個組織塊，共30個組織塊。分別計數(shù)貼壁生長的組織塊數(shù)量。②分離培養(yǎng)：螺旋神經(jīng)節(jié)組織塊在37 ℃的0.25%胰蛋白酶消化30 h，吹打數(shù)下至組織塊分散。加入胎牛血清至含量10%，靜置10 min終止消化。取上層細(xì)胞混懸液離心(4 ℃、200×g、3 min)。棄上清液，加入培養(yǎng)液重懸、混勻，約每6個蝸軸加1.5 mL培養(yǎng)液。細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿內(nèi)多聚賴氨酸加層粘連蛋白包被的玻片上，密度為200 μL/cm2，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h待貼壁，而后添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 螺旋神經(jīng)元及其神經(jīng)突的免疫熒光鑒定 培養(yǎng)玻片用PBS漂洗后，用-10～-20 ℃的甲醇固定15 min。PBS漂洗后，用1%山羊血清封閉30 min。再用神經(jīng)絲蛋白(neurofilament，NF)抗體(1∶500，200 kD，N4142，Sigma-Aldrich，美國)室溫下作用1 h，PBS漂洗后用Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶800，Molecular Probes，A-11008)作用1 h。PBS漂洗后再先后用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(1∶200，G6171，Sigma-Aldrich，美國)和Alexa Fluor 555熒光二抗(1∶500，Molecular Probes，A-21422)作用1 h。最后用4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(C1002，Beyotime，美國)作用1 h，以顯示細(xì)胞核。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察，計數(shù)組織塊中的神經(jīng)突總數(shù)和已長出組織塊周邊細(xì)胞毯的神經(jīng)突數(shù)量。用AxioVision 4.6.3軟件測量神經(jīng)突長度。

為區(qū)分神經(jīng)突極性，用微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein 2,MAP2)抗體和微管聚合蛋白(Tau-1)抗體分別標(biāo)記螺旋神經(jīng)元周圍突和中樞突。培養(yǎng)組織塊按上述方法經(jīng)固定、封閉后，先后用Tau-1抗體(1∶500，MAB3420，Millipore，美國)和IgG-TRITC熒光二抗(1∶200，T5393，Sigma-Aldrich，美國)分別在室溫下作用1 h。再先后用MAP2抗體(1∶800，Abcam,Cambridge，ab11267，英國)和Alexa Fluor 488熒光二抗(1∶800) 分別在室溫下作用1 h。最后在倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件，具體方法包括χ2檢驗和方差分析，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)方法對神經(jīng)突生長的影響 在螺旋神經(jīng)元的組織塊培養(yǎng)和分離培養(yǎng)體系中，主要有螺旋神經(jīng)元、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膜細(xì)胞(雪旺細(xì)胞)。螺旋神經(jīng)元通常有2個或2個以上細(xì)長突起，即神經(jīng)突；神經(jīng)膜細(xì)胞一般也有長突起形成。但是，螺旋神經(jīng)元的神經(jīng)突較細(xì)且粗細(xì)均一，有曲張體和生長錐等特征性結(jié)構(gòu)；而神經(jīng)膜細(xì)胞的神經(jīng)突較粗，在胞體的起始部位突起有明顯由粗變細(xì)的特征。成纖維細(xì)胞通常有不規(guī)則的胞體，有時也有較短的突起。在分離培養(yǎng)體系中，上述突起往往混雜在一起，或者被細(xì)胞體遮蓋，在相差顯微鏡下難以辨別(附3頁圖1)。在組織塊培養(yǎng)體系中，大部分神經(jīng)突也生長在組織塊周圍的細(xì)胞毯中，難以在相差顯微鏡下辨認(rèn)。但是有少部分神經(jīng)突進(jìn)入細(xì)胞毯外的“潔凈”環(huán)境中生長，稱為“自由神經(jīng)突”[12]。這時，在神經(jīng)突的生長方向及其周圍沒有其他細(xì)胞和突起的干擾，而且在相差顯微鏡下依據(jù)其上的曲張體和生長錐等結(jié)構(gòu)特點即可辨認(rèn)。在這些“自由神經(jīng)突”的胞體端，通常有神經(jīng)膜細(xì)胞伴隨生長(附3頁圖2)。

2.2 培養(yǎng)底物對神經(jīng)突生長的影響 ①采用不同底物進(jìn)行螺旋神經(jīng)元的組織塊培養(yǎng)時，組織塊的貼壁情況各不相同(附3頁圖3)。組織塊貼壁比率分別為：L組60.0%(18/30)、 P組83.3%(25/30)、P+L組86.7%(26/30)、C+L組100%(30/30)和 C組93.3%(28/30)，經(jīng)χ2檢驗，P組、P+L組、C組、C+L組各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均gt;0.05)，上述各組與L組之間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均lt;0.05)。②各組織塊長出的神經(jīng)突平均數(shù)量分別為：L組8.7(156/18)、P組7.9(197/25)、P+L組7.8(203/26)、C+L組2.2(65/30)和C組1.1(30/28)，P組、L組和P+L組各組與C組、C+L組各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均lt;0.05)。③各組織塊長出的“自由神經(jīng)突”的平均數(shù)量分別為：L組0.56(10/18)、P組0.44(11/25)、P+L組0.65(17/26)、C+L組0.07(2/30)和C組0(0/28)，P組、L組和P+L組各組與C組、C+L組各組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均lt;0.05)。④“自由神經(jīng)突”的平均長度分別為：L組(760.21±43.11)μm、P組(553.95±32.79)μm、P+L組(829.57±55.39)μm，L組和P+L組兩組與P組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均lt;0.05)，L組與P+L組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。除標(biāo)明的之外，上述各組間比較均采用方差分析。

2.3 “自由神經(jīng)突” 培養(yǎng)有“自由神經(jīng)突”的圓形小玻片可用小鑷子移入活細(xì)胞長時間觀察系統(tǒng)中的培養(yǎng)裝置內(nèi)。玻片的方位可以任意調(diào)整，以使神經(jīng)突與產(chǎn)生或釋放神經(jīng)突導(dǎo)向信號的裝置(如電極或毛細(xì)玻璃管等)之間形成特定的方位，利于神經(jīng)突的導(dǎo)向研究。培養(yǎng)有“自由神經(jīng)突”的玻片移入螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突電場導(dǎo)向研究系統(tǒng)中，后者由自動定時拍攝的倒置相差顯微鏡和帶有溫度和CO2控制活細(xì)胞的培養(yǎng)觀察裝置以及安裝電極并連接電流發(fā)生裝置的培養(yǎng)皿組成[12]。可用細(xì)針調(diào)整玻片的方位，使神經(jīng)突末端方位與電場方向之間形成特定角度，觀察神經(jīng)突在不同電場作用下的生長偏向性。

2.4 神經(jīng)突的極性 組織塊培養(yǎng)體系中的神經(jīng)突包括“自由神經(jīng)突”可被Tau-1抗體標(biāo)記，而不能被MAP2抗體標(biāo)記。成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膜細(xì)胞的胞體和突起均不能被兩者標(biāo)記(附4頁圖4)。

3 討論

3.1 培養(yǎng)方法對神經(jīng)突生長的影響 分離培養(yǎng)是通常采用的培養(yǎng)體系，如雞胚背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和非洲爪蟾胚胎脊髓神經(jīng)元的分離培養(yǎng)等[13-15]。神經(jīng)突的導(dǎo)向研究需要單離的神經(jīng)突，其生長延伸應(yīng)處于無其他細(xì)胞和物質(zhì)阻擋和干擾的潔凈環(huán)境；同時還應(yīng)有足夠的空間在神經(jīng)突周圍放置釋放導(dǎo)向因素的裝置，如微電極和毛細(xì)玻璃管等。然而分離培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)體系中，螺旋神經(jīng)元的神經(jīng)突與神經(jīng)膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞混雜在一起，在相差顯微鏡下無法辨認(rèn)；而且神經(jīng)突的周圍和延伸方向上的細(xì)胞成分將對神經(jīng)突的延伸形成干擾，因而影響導(dǎo)向因素作用的分析。在以往關(guān)于螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突生長的相關(guān)研究中，更常采用組織塊培養(yǎng)的方法[8-11]。在這些研究中，采用微圖形化導(dǎo)向因子研究對培養(yǎng)在其上神經(jīng)突的導(dǎo)向作用，即將不可溶的導(dǎo)向因子包被在培養(yǎng)底物上，使之成邊界、條帶或斑塊的微圖形?？扇苄缘膶?dǎo)向因子則以離散的液體濃度或由固定位置細(xì)胞釋放的形式研究其導(dǎo)向作用。然而，由于神經(jīng)突由胞體發(fā)出的部位是不可預(yù)知的、不均勻的，也是無法確定的，因而難以準(zhǔn)確判斷分析神經(jīng)突生長的偏轉(zhuǎn)情況，影響神經(jīng)突導(dǎo)向研究的精確性和效率。此外，神經(jīng)突導(dǎo)向研究中普遍應(yīng)用的必要工具——活細(xì)胞長時間觀察記錄裝置，在這些研究中沒有采用，因而難以確定神經(jīng)突的生長過程中是否受到干擾或阻礙。

在作者的前期研究中已證實，采用組織塊培養(yǎng)獲取的“自由神經(jīng)突”可在相差顯微鏡下依據(jù)形態(tài)進(jìn)行辨認(rèn)；培養(yǎng)于可移動玻片上的“自由神經(jīng)突”可針對導(dǎo)向因子釋放裝置任意調(diào)整方位[12]。這種可移動玻片上的神經(jīng)突不僅適合螺旋神經(jīng)元的神經(jīng)突導(dǎo)向研究，也有助于其他神經(jīng)元的神經(jīng)突導(dǎo)向研究。

3.2 不同培養(yǎng)底物對神經(jīng)突生長的影響 本研究比較了3種常用的細(xì)胞培養(yǎng)底物對螺旋神經(jīng)元組織塊貼壁和神經(jīng)突生長的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)底物不僅影響組織塊的貼壁，而且影響神經(jīng)突的生長。近幾年，I型膠原蛋白廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的構(gòu)建[16-18]。在本研究中，使用I型膠原蛋白或I型膠原蛋白加層粘連蛋白作為底物時，螺旋神經(jīng)元的組織塊更容易貼壁。但是，神經(jīng)突的長出數(shù)量和生長速度均較差，這表明I型膠原蛋白不適合作為底物培養(yǎng)螺旋神經(jīng)元。多聚賴氨酸和層粘連蛋白是常用的細(xì)胞培養(yǎng)底物。以往研究表明，層粘連蛋白作為培養(yǎng)底物能促進(jìn)螺旋神經(jīng)元神經(jīng)突的生長，而且隨著包被濃度的增加，神經(jīng)突的數(shù)量和長度逐漸增加[19]。單純層粘連蛋白作為底物時，組織塊的貼壁率較低，但“自由神經(jīng)突”的數(shù)量和神經(jīng)突的生長情況能夠滿足神經(jīng)突導(dǎo)向研究的需要。相反，多聚賴氨酸作為底物時，“自由神經(jīng)突”的數(shù)量較少，神經(jīng)突的生長速度較慢，但組織塊的貼壁率較高。而預(yù)先包被多聚賴氨酸，再包被層粘連蛋白可以增加組織塊的貼壁率，同時又能獲得較多生長良好的“自由神經(jīng)突”，是適合神經(jīng)突導(dǎo)向研究的螺旋神經(jīng)元培養(yǎng)底物。

3.3 神經(jīng)突的極性 為確定本研究中組織塊培養(yǎng)體系中神經(jīng)突的極性，我們使用MAP2抗體和Tau-1抗體來進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)果神經(jīng)突可被Tau-1標(biāo)記而不能被MAP2標(biāo)記。然而這并不能完全斷定本研究中的神經(jīng)突為軸突。MAP2抗體和Tau-1抗體分別是廣泛使用的樹突和軸突標(biāo)記物，是目前鑒別神經(jīng)突極性的通用標(biāo)記物。有研究表明，在雞體內(nèi)的前庭耳蝸神經(jīng)中，MAP2抗體能夠標(biāo)記胞體和周圍突，而不能標(biāo)記中樞突；然而在分離培養(yǎng)體系中(如培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié))，MAP2抗體能夠標(biāo)記的只有神經(jīng)突的起始部分和胞體[20-21]。在體內(nèi)，Tau-1 抗體只能標(biāo)記神經(jīng)元軸突，而不能標(biāo)記胞體和樹突以及其他種類的細(xì)胞[22]。然而體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的軸突、胞體和樹突都能夠被Tau-1抗體標(biāo)記[23]。這些研究表明，體外培養(yǎng)神經(jīng)元的神經(jīng)突與體內(nèi)的神經(jīng)突不同，能夠被Tau-1標(biāo)記，而不能被MAP2標(biāo)記，可能是極性沒有發(fā)育成熟的神經(jīng)突。其他研究也表明，體外培養(yǎng)神經(jīng)元的神經(jīng)突可發(fā)育成樹突，也可發(fā)育成軸突，成熟和發(fā)育中的神經(jīng)元樹突也能夠轉(zhuǎn)化為軸突[24]。因而，本研究中神經(jīng)突可能也是極性未發(fā)育成熟的神經(jīng)突。

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2011-01-05)

(本文編輯 楊美琴)

Neuritesofspiralganglionneuronssuitingforneuriteguidanceinvestigationinvitro

LIShu-feng,WANGZheng-min,LIWen＊.DepartmentofOtolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：WANG Zheng-min,Email:fjswzm@gmail.com

ObjectiveTo investigate a method of cell culture suiting for neurite guidance research of spiral ganglion neurons.MethodsThe authors explored the extension and development of spiral ganglion neurites from neonatal Sprague-Dawley rats by either explant culture or disassociated culture.In addition,the impact of different substratums(including poly-D-lysine,laminin and collagen I) on neurite extension was studied.To differentiate dendrites and axons,immunofluorescence for microtubule associated protein 2(MAP2) and Tau-1 was observed.ResultsThere were a few neurites that grew out of the cell blanket to a clean area in the explant culture of spiral ganglion neurons on movable slides.The direction of neurite extension appeared random because there was no interference from other cells,which was a characteristic suiting for the investigation of neurite guidance.Explants on poly-D-lysine plus laminin had relatively higher adhesion ratio,more and longer “free” neuritis than explants on other substratum.The neurites in the spiral ganglion explants could be labeled by anti-Tau-1 but not anti-MAP2.ConclusionsIncubating free neurites on poly-D-lysine plus laminin-coated movable slides was suitable for neurite guidance research of spiral ganglion neuronsinvitro.The polarity of neurites in explant culture system was immature.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:82-85)

Spiral ganglion neuron; Axon guidance; Neurite; Explant culture; Poly-D-lysine; Laminin

上海市衛(wèi)生局青年科研項目資助(2008Y100)

復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科

＊實驗中心上海 200031

王正敏(Email:fjswzm@gmail.com)