豬傳染性疾病診斷的國家標準、行業(yè)標準與國際標準的比較及適用性評估

史喜菊，馬貴平，劉全國，李炎鑫，李冰玲

（北京出入境檢驗檢疫局，北京 100026）

1 前言

國際動物衛(wèi)生組織（OIE）制定的動物衛(wèi)生標準是WTO中SPS協(xié)定唯一認可的動物衛(wèi)生規(guī)則，作為技術法規(guī)和仲裁國際貿易糾紛的技術依據，得到了世界各國獸醫(yī)工作者的一致認可。OIE的診斷標準體系完善、內容科學，有分布于全球的OIE參考實驗室作為技術后盾，這些診斷技術代表了全世界獸醫(yī)工作的最高水平，科學性、實用性和先進性都很強，是世界各國在獸醫(yī)技術能力建設上所參照的國際標準。隨著全球經濟一體化進程的加快，動物和動物產品的國際貿易也進入了國際競爭時代，各國對動物的健康狀況和衛(wèi)生水平以及動物產品的安全性提出了更加苛刻的要求，一些國家借此設置各種貿易技術壁壘，限制別國的產品出口，以此實現貿易保護。近年來我國動物檢疫標準的制修訂工作取得了一定的成績，但還沒有建立起與國際接軌的動物衛(wèi)生標準體系，用國際標準衡量時，我們所制定的標準的技術水平和內容的涵蓋范圍還有諸多不足，動物衛(wèi)生標準化工作還遠不能適應入世后的貿易和社會發(fā)展需要。為了應對國際貿易的需要，促進國家標準、國家法規(guī)的協(xié)調性特別是與國際標準的接軌，現以OIE規(guī)定的豬傳染性疾?。?1種）為例進行國家標準、行業(yè)標準與國際標準的比較及適用性評估，為動物檢疫標準的制修訂工作提供參考。

2 豬傳染性疾病診斷的國家標準、行業(yè)標準與國際標準的比較及適用性評估

2.1 非洲豬瘟（African swine fever）的診斷標準及適用性評估

非洲豬瘟的OIE診斷標準包括紅細胞吸附試驗、熒光抗體試驗、病毒基因組檢測、動物接種試驗及ELISA、間接熒光抗體試驗、免疫印跡試驗和逆向免疫電泳試驗，共計8個方法標準。其中紅細胞吸附試驗可以檢測組織和外周血中的病毒，對非洲豬瘟的診斷是確定的；熒光抗體試驗檢測病毒抗原進行假定診斷，鑒定非紅細胞吸附型毒株，鑒別ASFV和其他病毒引起的細胞病變，在亞急性和慢性病例中敏感性降低；病毒基因檢測可以檢測和鑒別所有已知的病毒基因型，對不適合病毒分離或抗原檢測的組織特別有用；動物接種試驗過去用于區(qū)別古典豬瘟和非洲豬瘟，周期長、昂貴，操作困難，引起動物福利問題，不再推薦使用；ELISA直接檢測低毒力或中等毒力感染豬的ASFV抗體，用于大規(guī)模血清樣品的篩選，廣泛用作根除計劃，特異性和敏感性都很高，有商品化試劑盒供應，是國際貿易指定使用的試驗；間接熒光抗體試驗用作無ASF疫區(qū)ELISA陽性血清以及ELISA結果不確定地區(qū)的確診試驗；免疫印跡試驗用作間接熒光抗體試驗的替代試驗對有爭議的血清進行確診，特異性強，結果的解釋更加容易、更加客觀，能夠較好地鑒別弱陽性樣品；逆向免疫電泳檢測用于豬群的檢疫篩選，不建議用作個體豬的檢疫，快速，敏感性低。非洲豬瘟診斷的國家標準包括PCR和ELISA，檢驗檢疫行業(yè)標準包括紅血球吸附試驗、直接免疫熒光試驗和間接免疫熒光試驗，分別相應于OIE標準中的基因檢測、ELISA、紅細胞吸附試驗、熒光抗體試驗和間接熒光抗體試驗，缺失了OIE標準中的動物接種、免疫印跡和逆向免疫電泳試驗，建議加強這方面的標準制修訂。

2.2 豬萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis）的診斷標準及適用性評估

豬萎縮性鼻炎的OIE診斷標準包括病原培養(yǎng)、生化鑒定（莢膜分型、菌體抗原分型、毒素檢測）、核酸檢測及ELISA和凝集試驗，共計7個方法標準。其中病原培養(yǎng)可以從病料中直接分離病原菌，莢膜分型試驗使用間接血凝進行血清分型，用于流行病學調查，只有少數實驗室可以做；菌體抗原分型可以區(qū)別16個抗原型，很多參考實驗室和一些診斷實驗室都可以做；產毒性鑒定是診斷的依據，是鑒別帶菌豬和控制萎縮性鼻炎的首選方法，特異性強；核酸檢測用于檢測病原菌和莢膜分型，限制性內切酶是流行病學調查的首選方法，快速、特異和敏感；還沒有滿意的血清學試驗可用于檢測感染動物，產毒菌株和非產毒菌株有交叉反應，抗體檢測無意義，有商品化的檢測多殺性巴氏桿菌毒素抗體的ELISA試劑供應；凝集試驗可以檢測支氣管敗血波氏桿菌，但病原在明顯健康豬群中持續(xù)存在，只能用于監(jiān)控陰性畜群的健康地位。豬萎縮性鼻炎診斷的農業(yè)行業(yè)標準包括病原分離培養(yǎng)、莢膜分型、菌體抗原分型、毒素鑒定以及試管凝集、平板凝集，與OIE標準中的病原培養(yǎng)、生化特征鑒定以及血清凝集試驗相對應，缺少了OIE標準中的核酸檢測和ELISA試驗；目前還沒有相關國家標準和檢驗檢疫行業(yè)標準，建議加強這方面的標準制修訂。

2.3 豬瘟（Classical swine fever）的診斷標準及適用性評估

豬瘟診斷的OIE標準包括熒光抗體試驗、過氧化物酶免疫染色、抗原捕獲ELISA、病毒分離鑒定和反轉錄聚合酶鏈反應5種病原鑒定方法以及過氧化物酶中和試驗、熒光抗體病毒中和試驗與單抗ELISA三種血清學方法，共計8個方法標準。其中熒光抗體試驗是檢測冷凍切片上的病毒抗原，陰性結果并不能完全排除CSFV感染，建議專業(yè)實驗室使用；過氧化物酶染色可以區(qū)分田間分離株和疫苗免疫株，區(qū)別CSFV和其他瘟病毒；抗原捕獲ELISA篩選最近可疑感染的畜群以便能夠快速診斷，操作簡單，不需要組織培養(yǎng)設備，適合于自動化，敏感性不如病毒分離，特異性差，不適于個體診斷；病毒分離比免疫熒光試驗更加敏感，周期長；RT-PCR可以成功地控制疾病暴發(fā)，快速，比抗原捕獲ELISA或病毒分離更加敏感，特別適合于臨床前診斷，是歐盟和許多國家認可的快速篩選方法，初次陽性結果要通過其他方法確診；過氧化物酶中和試驗用于國際貿易目的和國家監(jiān)測計劃，是最常用的抗體檢測技術之一，結果容易判讀，是國際貿易指定使用的試驗；熒光抗體病毒中和試驗是常用的抗體檢測技術之一，是國際貿易指定使用的方法，稀釋度低時偶爾會產生交叉反應；單抗ELISA主要用于豬瘟抗體的鑒別診斷，可區(qū)別自然感染豬、免疫豬、強、弱毒抗體陽性豬和抗體陰性豬，敏感性非常高，是國際貿易指定使用的試驗。豬瘟診斷的國家標準包括兔體交互免疫試驗、免疫酶染色試驗、病毒分離與鑒定、直接免疫熒光抗體試驗、反轉錄聚合酶鏈反應以及熒光抗體病毒中和試驗與豬瘟單抗ELISA，其中的兔體交互免疫試驗是對國際標準的補充；檢驗檢疫行業(yè)標準包括免疫熒光技術、中和免疫熒光試驗以及單抗ELISA，分別對應于OIE標準中的熒光抗體試驗、過氧化物酶免疫試驗、病毒分離、RT-PCR、熒光抗體病毒中和試驗及單抗ELISA，缺失了OIE標準中的過氧化物酶中和試驗及抗原捕獲ELISA。

2.4 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome）的診斷標準及適用性評估

豬繁殖與呼吸綜合征診斷的OIE標準包括病毒分離、核酸檢測、免疫組化、免疫過氧化物酶單層試驗、間接免疫熒光試驗和間接ELISA，共計6個方法標準。其中病毒分離可以鑒定病毒，但比較困難；核酸檢測用于不適合做病毒分離的樣品，可以區(qū)分不同分離株，區(qū)別田間株和疫苗株，進行分子流行病學研究，快速、不需要細胞培養(yǎng)設備；免疫組化檢測組織中的病毒抗原，免疫過氧化物酶試驗檢測血清中的病毒抗體，間接免疫熒光試驗用于滴定血清抗體滴度，還沒有可以被廣泛接受的標準，主要用于北美洲國家；間接ELISA可以區(qū)分不同分離株，確定豬群的感染地位，操作簡單，在群體水平上特異敏感，可以快速處理大量樣品，有商品化試劑盒供應。檢驗檢疫行業(yè)標準包括病毒分離、免疫過氧化物酶單層試驗、間接免疫熒光試驗和間接ELISA，農業(yè)行業(yè)標準包括免疫酶試驗和免疫酶組織化學法，只是缺失了OIE標準中的核酸檢測，其余方法都與OIE標準相對應，國家標準目前還是空白，建議將相關行業(yè)標準上升為國家標準。

2.5 豬水泡?。⊿wine vesicular disease）的診斷標準及適用性評估

豬水泡病診斷的OIE標準包括病毒分離與鑒定、ELISA檢測抗原、核酸檢測、病毒中和試驗以及ELISA檢測抗體，共計5個方法標準。其中病毒分離與鑒定是鑒定病毒的參考方法，不足以用ELISA和RT-PCR檢測的樣品需要進行病毒分離；間接夾心ELISA檢測病毒抗原已經取代補體結合實驗成為首選方法，適合于快速篩選，具有與病毒分離同樣的診斷價值；核酸檢測從臨床和亞臨床病例中檢測病毒基因組，適合于快速篩選，具有與病毒分離同樣的診斷價值；病毒中和試驗用于實驗室確診、血清學監(jiān)測和豬的出口認證，常用的血清學檢測技術之一，得到認可的標準方法，耗時長，是國際貿易指定使用的方法；ELISA抗體檢測用于實驗室確診、血清學監(jiān)測和豬的出口認證，常用的血清學檢測技術之一，快速，容易標準化，單抗競爭ELISA是檢測病毒抗體的可靠技術。相關國家標準包括病毒分離鑒定、反向間接血凝試驗、瓊擴、病毒中和試驗以及熒光RT-PCR，其中反向間接血凝試驗和瓊擴試驗是對OIE標準的補充，都適用于大批樣品的篩選，適用于檢疫、監(jiān)測、流行病學調查和無本病豬群的建立，缺失了OIE標準中的ELISA抗原、抗體檢測技術；檢驗檢疫行業(yè)標準只有一個病毒中和試驗，建議申請反向間接血凝和瓊擴試驗的國際認證，加強和完善其他缺失方法的標準制修訂。

2.6 豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis）的診斷標準及適用性評估

豬傳染性胃腸炎診斷的OIE標準包括病毒分離、熒光抗體檢測、雙抗體夾心ELISA、核酸檢測、病毒中和試驗、阻斷或間接ELISA，共計6個方法標準。其中病毒分離是除活豬接種之外最確定的診斷方法，費時費力，不適合于常規(guī)檢測；熒光抗體檢測鑒定病毒抗原，快速、敏感、特異性強；雙抗體夾心ELISA可以檢測糞便中的病毒抗原，核酸檢測可以直接檢測臨床樣品中的病毒；病毒中和試驗很多年來得到非常廣泛的使用，通常作為評價其他新方法的標準；阻斷或間接ELISA可以與豬呼吸道冠狀病毒進行鑒別診斷，是出口檢疫的首選方法，有商品化試劑盒供應。檢驗檢疫行業(yè)標準包括阻斷ELISA、血清中和試驗，農業(yè)行業(yè)標準包括病毒分離鑒定、直接免疫熒光法、雙抗體夾心ELISA、中和試驗、間接ELISA，這幾個方法都與OIE標準相對應，只是缺失OIE標準中的核酸檢測，核酸檢測具有快速、靈敏等優(yōu)點，建議加強這方面的標準制修訂任務，同時加快行業(yè)標準向國家標準的升級轉化。

2.7 診斷標準與OIE標準差距很大的幾種豬傳染性疾病

OIE所列豬傳染性疾病共有11種，除上述6種之外，其他5種我國都沒有相關國家標準或行業(yè)標準，與OIE標準差距很大。這5種疾病包括尼帕病毒性腦炎（Nipah virus encephalitis）、豬布氏桿菌?。≒orcine Brucellosis）、豬 囊 蟲 ?。≒orcine cysticercosis）、豬 流感（Swine infl uenza）、豬腸道病毒醒腦脊髓炎 /捷申 病（enterovirus encephalomyelitis/ Teschen/Talfan disease），這5種疾病的OIE標準都比較完善，但我國卻沒有這方面的標準，特別是尼帕病毒性腦炎是新發(fā)外來傳染病，傳染性很強，我們必須做好技術儲備防治外來并入侵。豬流感病毒是人畜共患傳染病，特別是今年甲型H1N1流感病毒在世界范圍內的流行更加劇了本病的嚴重危害性，建議加強這方面的標準制修訂任務。

2.8 超出OIE標準范圍的幾種豬傳染性疾病

根據我國動物疫病發(fā)病的實際特征，結合我國具體情況，研究人員還制定了沒有列入OIE標準但是在我國比較嚴重的幾種豬傳染性疾病，包括豬細小病毒病、豬流行性腹瀉和豬傳染性胸膜肺炎等。有關豬細小病毒的標準有豬細小病毒紅細胞凝集抑制試驗與聚合酶鏈反應；有關豬流行性腹瀉的標準有病毒分離鑒定、直接免疫熒光試驗、雙抗體夾心ELISA、血清中和試驗、間接ELISA以及間接Dot-ELISA，內容比較豐富完善；有關豬傳染性胸膜肺炎的標準包括聚合酶鏈反應和阻斷ELISA。這些技術如果成熟，建議申請國際標準認可。

3 比較、評估結論與建議

通過比較發(fā)現，我國豬傳染性疾病的診斷標準與國際標準存在的差異比較大。具體表現在：（1）有一些標準是OIE手冊中沒有提及的，如豬細小病毒的紅細胞凝集抑制試驗與聚合酶鏈反應，豬流行性腹瀉的病毒分離鑒定、直接免疫熒光試驗、雙抗體夾心ELISA、血清中和試驗、間接ELISA以及間接Dot-ELISA等，以及豬傳染性胸膜肺炎的聚合酶鏈反應和阻斷ELISA等。這些標準都是我國相關科研單位根據國家疫病發(fā)生的實際情況制定的。這樣做提升了標準的適用性，更加符合疫病防控的迫切需要，是對國際標準的補充，如果技術成熟，建議可以申請成為國際標準。（2）有一些標準內容比較全面，技術含量高，科學性強，具有一定的先進性，與國際標準比較接近，可以滿足國際貿易的需要。（3）有一些標準內容不全面，只包括了OIE標準中的部分內容，落后于國際標準，特別是OIE推薦的國際貿易規(guī)定要使用的方法在我國缺失，這類標準要加快修訂和更新，以便能適應國際貿易的需要。（4）有一些標準與國際標準差距很大，比較成熟的國際標準在我國還是空白，如，尼帕病毒性腦炎、豬布氏桿菌病、豬囊蟲病、豬流感及豬腸道病毒醒腦脊髓炎/捷申病。一旦遇到國際貿易要求對這些疾病進行檢疫，我們將無法應對，陷入被動，建議必須加快這方面的標準制修訂任務。（5）有一些行業(yè)標準與國家標準的內容相互交叉、重復甚或矛盾，這種情況需要進行清理整合。

鑒于上述豬傳染性疾病診斷的國家標準、行業(yè)標準與國際標準存在的差距，建議（1）從OIE參考實驗室引進重大動物疫病的診斷試劑和方法，選取國內資質條件好的實驗室對目前我國已經制定的動物檢疫標準進行驗證和復核。驗證合格者，推薦使用，并推薦申請OIE的國際認可；驗證有小幅差距者，暫停使用，待完善達標后再推薦使用；不合格者，停止使用，撤消標準。這樣做有利于提高我國口岸動物檢疫實驗室的水平，有利于我國動物檢疫標準與國際標準同等地位的確立，可以推動我國動物及動物產品的出口貿易，同時更好地防范外來動物疫病入侵，更好地把好國門。（2）遵照OIE標準的要求，制定一個系統(tǒng)、完整的國家標準或行業(yè)標準制定體系或框架，在該體系或框架的指導下，對現有標準進行清理整合、特別是對于那些內容交叉重復甚或矛盾的部分進行徹底清理，內容陳舊的標準進行更新修訂，過期或不適用的標準進行作廢處理，缺失的標準加緊制修訂，使我國的標準制修訂工作逐步進入一個有序狀態(tài)，按計劃進行。

[1] 馬貴平，史喜菊，李冰玲，等.多種動物共患傳染病診斷的國家標準、行業(yè)標準與國際標準的比較及適用性評估[J].中國動物檢疫，2010，27（10）：66-69.

[2] 史喜菊，馬貴平，李冰玲，等.牛傳染病診斷的國家標準、行業(yè)標準與國際標準的比較及適用性評估[J].中國動物檢疫，2010，27（11）：64-67.

[3] World Organization for Animal Health（OIE）.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals，2011[M/OL].http：//www.oie.int/international-standard-setting/terrestrialmanual/access-online/.