蜂王漿組蛋白脫乙酰酶抑制物活性——10-HDA可能是蜜蜂極型分化的主要活性物質

由美國、中國和意大利的研究人員組成的研究小組最新研究發(fā)現，蜂王發(fā)育這一表觀遺傳現象可部分地歸因于蜂王漿中含有的組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）活性，而蜂王漿中的10-HDA可能是承擔這一活性的主要物質。此研究是繼蜂王漿含有的營養(yǎng)物質在級型分化中起作用之后，首次從表觀遺傳調控因子角度探索蜂王漿中起作用的活性物質。這一結果在線發(fā)表在今年2月18日的EMBO雜志上。

蜜蜂蜂王和工蜂間的分化是由于幼蟲得到的食物不同而引發(fā)的。前三天，所有幼蟲都食用蜂王漿。此后，工蜂幼蟲的食譜開始以蜂蜜和花粉為主，而蜂王幼蟲繼續(xù)享用蜂王漿，并且得到充足的飼喂。這蜂王食譜使得蜂王與工蜂在形態(tài)、行為和生理方面都差別巨大，并且具有比普通工蜂長約20倍的壽命。這一食物攝入有多方面的影響：激活胰島素信號級聯反應，影響大腦釋放激素，調控整體的表觀遺傳改變。蜂王漿在其中扮演著關鍵的角色。蜂王漿成分復雜，包括水、蛋白質類物質、脂肪酸、糖類、維生素和礦物質。到目前為止，對蜂王漿含有的在級型分化過程中起作用的物質的認識主要是蛋白質和糖類等營養(yǎng)作用成分。研究表明，蜂王表型是由表觀遺傳機制引起的。此課題組發(fā)現蜂王漿具有表觀遺傳活性，研究人員把承擔這一活性的組分定位到了10-HDA。

在哺乳動物中，營養(yǎng)通過影響基因組的表觀遺傳狀態(tài)，直接調控基因表達和發(fā)育。維持表觀遺傳狀態(tài)的酶包括DNA甲基轉移酶、組蛋白乙酰化酶和脫乙酰酶，以及組蛋白甲基轉移酶和脫甲基酶。其中任何一種酶都能成為營養(yǎng)因子的靶標。對蜂王和工蜂大腦DNA甲基化模式進行比較，發(fā)現甲基化的CpGs數量沒有差別，但甲基化位點卻不盡相同，尤其是在外顯子區(qū)，這就會影響可變剪接。此外，小干擾RNA導致的新孵化的蜜蜂幼蟲Dnmt3水平的下降使得該幼蟲發(fā)育成具有充分發(fā)育的卵巢的蜂王。因此，對蜜蜂幼蟲注射Dnmt3 siRNA可以代替蜂王漿攝入對蜜蜂級型發(fā)育軌道產生的影響。這些研究表明蜂王漿的某組分有調控表觀遺傳途徑的能力。該課題組根據RNA引起的蜜蜂幼蟲Dnmt3水平的下降導致該幼蟲發(fā)育成蜂王這一結果，推測蜂王漿具有調控DNA甲基化的活性。他們便利用K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統檢測2種濃度的蜂王漿（0.5%和1%）的表觀遺傳調控活性。發(fā)現這兩種濃度的蜂王漿與一種DNA甲基化抑制因子——5-Aza作用相似。然后，用一個超濾膜分餾王漿中3 kDa的組分，試驗表明其中＜3kDa低分子量的組分具有與5-Aza相似的作用。這一結果——以及蛋白激酶K處理王漿沒有降低王漿此活性——表明蜂王漿具有表觀遺傳調控活性，且活性組分可能是一種非蛋白源的小分子。

接著，該課題組就把目標定到了蜂王漿中的小分子——10-HDA，因為它是蜂王漿的主要組分之一，占干物質的2%～6%，已有證據表明其在哺乳動物細胞具有生物學效力。于是，他們再一次利用K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統，發(fā)現5mMd 10HDA溶液的確具有表觀遺傳調控活性。

為了證明10-HDA的表觀遺傳活性并非限于在K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統，他們在第二個表觀遺傳報告系統——GF2-4細胞報告系統中檢測了10-HDA的活性，這個系統基于重新激活一個具有高度CpG甲基化而沉默的GFP基因。他們單獨用10-HDA或10-HDA與5-Aza的混合物分別處理細胞，發(fā)現10-HDA不能獨自激活沉默的GFP位點，但能與5-Aza進行功能協同從而加強GFP位點的表達。進一步研究發(fā)現10-HDA與丁酸鈉作用方式相似，丁酸鈉是一個被廣泛證明的HDACi。這些數據表明10-HDA本身不具有DNA脫甲基物質的功能，但是參與一個抑制基因轉錄的途徑，這一途徑與DNA甲基化途徑平行。

他們又在第三個模型系統——SW48細胞（一個人類克隆癌細胞系）報告系統中進行了研究，結果得到了和第二個系統相同的結果，即10-HDA不能獨自激活沉默的GFP位點，但可明顯加強5-Aza激活GFP的能力。此外，在此細胞系，蜂王漿和10-HDA都能重激活表觀遺傳沉默的p21的表達。為直接檢測10-HDA能否抑制DNA甲基化，他們對LINE-1（long interspersed nuclear element）重復元件進行測序，檢測細胞整體的甲基化情況。結果，5-Aza處理組DNA甲基化水平降低了50%，而10-HDA不能獨自降低LINE-1DNA甲基化水平，也不能增強5-Aza的效力。況且，蜂王漿處理（0.4%和4%，v/v）也沒有對LINE-1元件的DNA甲基化水平產生影響。

他們又檢測了10-HDA處理后CMV啟動子的甲基化水平，發(fā)現沒有降低。因此，10-HDA不是一個DNA甲基轉移酶抑制物。那么，有可能10-HDA不是表觀遺傳因子的直接調控者，而是干擾超細胞信號調控激酶（ERK）或磷酸肌醇3激酶（PI3K）信號通路，從而把K-ras與表觀遺傳調控因子聯系到一起。但試驗發(fā)現10-HDA不對任何上述信號通路造成影響，表明10-HDA是直接靶向表觀遺傳影響分子。

基于10-HDA本身不能抑制DNA甲基化，但可與DNA脫甲基物質協同作用，而且與已知的HDACi復合物結構相似，他們又對10-HDA是不是一個HDACi進行了研究。結果顯示10-HDA抑制了HDAC活性或推動了組蛋白乙酰轉移酶活性。接著，體外實驗直接檢測到10-HDA和王漿確實具有抑制HDAC活性。需要注意的是，本實驗用的蜂王漿含有2%的10-HDA，稀釋100倍后10-HDA濃度為1mM，而稀釋100倍的王漿溶液和1mM 10-HDA溶液功效相似，因此，推測蜂王漿中HDACi活性大部分是由10-HDA承擔的。9-ODA是10-HDA的類似物，由蜂王產生，且其具有與HDACi相似的活性，因此9-ODA酸的活性也可能對蜂王表型的維持起到重要作用。

最后，他們再次利用K-ras-transformed NIH 3T3細胞報告系統，比較了TSA（一種HDACi）、丁酸鈉和10-HDA的效力，以及用重組的HDAC1,3,8,10,11進行獨立的抑制試驗，一再證實了10-HDA的HDACi活性。

此研究試驗設計比較嚴密，具有較大的說服力。但要證明10-HDA的確能對蜂王發(fā)育產生影響，筆者認為仍存在一些疑問需要進一步驗證：（1）需要設計體內試驗檢測10-HDA是否對蜜蜂蜂王發(fā)育產生影響；（2）3齡后的工蜂食物中含有一定量的蜂王漿，需要檢測工蜂食物中是否仍含有10-HDA；（3）如果工蜂漿中含有10-HDA，那是否對工蜂發(fā)育也產生影響？（4）如果10-HDA對工蜂發(fā)育和蜂王發(fā)育都產生影響，那調控方式差別是什么？是表觀遺傳數量的還是位點的差別？（5）雖然稀釋100倍的蜂王漿溶液和1mM 10-HDA溶液功效相似，那蜂王漿除掉10-HDA后的組分，是否不具備HDACi活性？也就是說蜂王漿的HDACi活性是否僅有10-HDA承擔？

浙江大學動物科學學院 陳璇 胡福良編譯