藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響因素

董燕,刁玲武,周聯(lián)

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)免疫與分子生物學(xué)研究室,廣東 廣州 510405)

近年來(lái),隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展,對(duì)藥用植物的用量及質(zhì)量要求不斷提升。我國(guó)雖有豐富的野生中藥資源,卻因生態(tài)環(huán)境的不斷破壞、無(wú)計(jì)劃的采伐等因素,有限的野生藥用植物資源日益減縮。通過(guò)大田栽培藥用植物是目前滿足中藥市場(chǎng)的一種有效手段,但這必然占用大量可耕種土地,引起藥用植物栽培與農(nóng)作物種植爭(zhēng)地的矛盾。同時(shí),如人參等一些藥用植物的栽培會(huì)導(dǎo)致大量山林被砍,造成水土流失、生態(tài)環(huán)境的破壞及生物多樣性的流失等問(wèn)題。

生物技術(shù)的不斷發(fā)展,為藥用植物的研究和發(fā)展提供了良機(jī)和手段。將植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于藥用植物,可在完全人工控制的條件下獲得藥用植物細(xì)胞及其次生代謝產(chǎn)物,從而有效解決野生資源不足及占用大量土地的問(wèn)題。

1 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指植物細(xì)胞或小的細(xì)胞聚集體在不斷攪動(dòng)或搖動(dòng)的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。其特點(diǎn)是在完全人工控制的條件下進(jìn)行,不受地區(qū)、季節(jié)、土壤及有害生物的影響,且生產(chǎn)周期較短,可通過(guò)選擇優(yōu)良培養(yǎng)體系和改變培養(yǎng)條件獲得超過(guò)傳統(tǒng)植物栽培所得的代謝產(chǎn)物。

1954年,M uir等第一次進(jìn)行了植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng),自上世紀(jì)六十年代,開(kāi)始應(yīng)用于藥用植物次生代謝物的生產(chǎn),至八九十年代,可批量獲得藥用植物細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物,如抗癌藥物紫杉醇及抗菌藥小檗堿等[1]。

目前,用于細(xì)胞培養(yǎng)的藥用植物已有 200多種,可產(chǎn)生 500多種有效成分,如培養(yǎng)人參細(xì)胞生產(chǎn)保健藥物人參皂苷、紫草細(xì)胞生產(chǎn)療傷藥物紫草寧、黃連細(xì)胞生產(chǎn)抗菌藥物小檗堿、長(zhǎng)春花細(xì)胞生產(chǎn)阿嗎堿、紫松果

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30772737);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(5004272)

作者簡(jiǎn)介:董燕 (1969-),女,副研究員,博士,主要從事分子生物學(xué)技術(shù)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用方向的科研與教學(xué)工作。

收稿日期:2010-12-15

修回日期:2011-01-04

菊細(xì)胞生產(chǎn)免疫活性多糖、紅豆杉細(xì)胞生產(chǎn)抗腫瘤藥物紫杉醇等。從植物細(xì)胞培養(yǎng)中得到的藥用成分還有喜樹(shù)堿、莨菪堿、小檗堿、奎寧、地高辛、天仙子胺、山萆、芥皂疳元等。目前,中國(guó)科學(xué)院植物研究所的紫草培養(yǎng)、華中理工大學(xué)的紅豆杉培養(yǎng)和中國(guó)藥科大學(xué)的人參培養(yǎng)

[2]

等均已實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。另外,近年來(lái)利用植物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或不定根、發(fā)狀根對(duì)外源化學(xué)成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的研究也在悄然興起,并取得了一定的進(jìn)展。

隨著藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展,為中藥資源的可持續(xù)發(fā)展開(kāi)辟了一條新途徑。但建立良好的藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系,相關(guān)影響因素非常多,確定各因素的最佳條件是獲得良好藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的關(guān)鍵。

2 愈傷組織對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞大多來(lái)自愈傷組織,所以能否成功建立一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮系,首先取決于培養(yǎng)材料 -愈傷組織的狀態(tài)。愈傷組織繼代培養(yǎng)過(guò)程中,常常出現(xiàn)多種類型的愈傷組織,根據(jù)能否發(fā)生體細(xì)胞胚胎而將愈傷組織分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織兩種類型。只有胚性愈傷組織才有可能成功地建立胚性細(xì)胞懸浮系。而外植體的來(lái)源和狀態(tài)決定著其所誘導(dǎo)的愈傷組織的活力狀態(tài),進(jìn)而影響細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的質(zhì)量和單細(xì)胞的再生能力。

2.1 外植體的選擇

選擇適宜的外植體才能獲得良好的培養(yǎng)材料,最終才能成功建立一個(gè)分散性好、穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮體系。一般用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體以幼嫩的組織或器官及種子萌發(fā)的無(wú)菌苗為好。不同植物可選擇的外植體差異較大,木本及花卉則往往以葉片、莖尖、芽尖、花藥等為外植體,但也不是絕對(duì)的,木本植物杜仲在一定的培養(yǎng)條件下也可通過(guò)子葉和胚軸來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織[3]。草本植物及禾本科的幼穗、胚、成熟種子、花藥、胚軸、胚根、芽尖等均可作為外植體誘導(dǎo)愈傷。例如,草本藥用植物脹果甘草細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn),子葉來(lái)源的愈傷組織在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好,根來(lái)源的細(xì)胞在培養(yǎng)液中會(huì)迅速褐化而死,而下胚軸來(lái)源的愈傷組織的培養(yǎng)周期比葉來(lái)源的長(zhǎng)[4];草坪草一般以幼穗為外植體往往可獲得較成熟種子更高的愈傷誘導(dǎo)率,但材料受季節(jié)限制不易獲得,通常用成熟種子誘導(dǎo)愈傷組織。石斛等蘭科植物則直接采用原球莖細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。選擇合適的外植體才能獲得生長(zhǎng)快、疏松型的愈傷組織,為進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)打好基礎(chǔ)。

2.2 愈傷組織狀態(tài)

懸浮細(xì)胞系的建立通常是以生長(zhǎng)快、易散碎的松散型胚性愈傷組織為起始材料。而實(shí)驗(yàn)所得愈傷組織通常有 3種類型:I型為質(zhì)地堅(jiān)硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織;Ⅱ型為質(zhì)地疏松、易分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織;Ⅲ型為柔軟、水漬、形狀不規(guī)則、顏色淡白的非胚性愈傷組織。I型雖有胚性但質(zhì)硬,不容易分散;Ⅲ型活力不佳,不具胚性;為達(dá)到細(xì)胞懸浮培養(yǎng)分散性好的要求,結(jié)構(gòu)松脆、分裂能力強(qiáng)、增殖速度快,并且具有胚胎發(fā)生能力的Ⅱ型愈傷組織作為藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的材料是最佳的選擇[5-6]。

3 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

不同培養(yǎng)基中各成分的種類和濃度有異,對(duì)不同植物細(xì)胞生長(zhǎng)的影響迥然不同,所以選擇合適的培養(yǎng)基也是成功建立藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的重要因素之一。

3.1 基本培養(yǎng)基的選擇

基本培養(yǎng)基主要是無(wú)機(jī)鹽,而不同科屬的植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求不盡相同,所以在植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí),對(duì)無(wú)機(jī)鹽的種類及濃度要求也有所不同。植物主要常用的基本培養(yǎng)基有 W hite、Heller、M S、ER、B5及N 6等幾種。培養(yǎng)基中大量元素的濃度對(duì)懸浮培養(yǎng)愈傷組織細(xì)胞存活率有較大影響,如培養(yǎng)基中大量元素總濃度過(guò)高時(shí),枸杞懸浮系中除活細(xì)胞百分率降低外,還可看到許多細(xì)胞呈皺縮狀態(tài),這說(shuō)明培養(yǎng)液滲透壓過(guò)高[7]。目前研究表明,M S培養(yǎng)基有利于大部分藥用植物細(xì)胞的懸浮生長(zhǎng),如杜仲、紅景天、益母草、半夏、黃芩、紅豆杉及白木香等[3,8-13]。但對(duì)目的在于生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的細(xì)胞培養(yǎng),選擇培養(yǎng)基還需考慮到次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量,在促進(jìn)丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和水溶性酚酸含量的因素研究中就發(fā)現(xiàn),M S培養(yǎng)基雖有利于丹參懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng),但是 6,7-V培養(yǎng)基更利于丹參酚酸的合成積累,因此綜合考慮選擇 6,7-V培養(yǎng)基作為丹參懸浮細(xì)胞培養(yǎng)基最佳[14]。但也有研究認(rèn)為,改良的 B5培養(yǎng)基利于愈傷組織的誘導(dǎo)及后繼的培養(yǎng),在建立印楝懸浮細(xì)胞系時(shí),發(fā)現(xiàn) B5培養(yǎng)基優(yōu)于M S培養(yǎng)基,將愈傷組織接種在 B5培養(yǎng)基中易得到比較均勻的懸浮培養(yǎng)系,且細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,但在M S培養(yǎng)基中的愈傷組織懸浮起來(lái)比較困難,生長(zhǎng)緩慢并出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象[15]。

3.2 激素種類和濃度

激素是調(diào)節(jié)植物細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和代謝產(chǎn)物形成的主要物質(zhì),植物激素的種類和濃度的差異對(duì)不同種類的植物細(xì)胞生長(zhǎng)有不一樣的影響。

首先,激素在獲得培養(yǎng)材料 -愈傷組織時(shí)就充當(dāng)著極其重要的因素,通常當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素濃度比例高時(shí),易誘導(dǎo)根;當(dāng)比例適當(dāng)時(shí),只誘導(dǎo)愈傷組織,而不產(chǎn)生根和芽;當(dāng)二者的比例小時(shí),誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生[16]。然而,不同藥用植物所需要的激素種類及激素的絕對(duì)量不盡相同,需根據(jù)不同種類藥用植物的需求進(jìn)行添加。一般認(rèn)為以 2,4-D組合其它種類的激素是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳選擇,對(duì)南方紅豆杉及輪葉黨參愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果就表明,2,4-D比萘乙酸(NAA)更有利于愈傷組織的形成[17-18]。

其次,在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),激素是影響細(xì)胞狀態(tài)及次生代謝物形成的重要調(diào)控因素。激素種類選擇不當(dāng)、濃度過(guò)低或過(guò)高,會(huì)對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成產(chǎn)生抑制作用。雷公藤愈傷組織懸浮培養(yǎng)中,在含 2,4-D的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最慢,干培養(yǎng)物產(chǎn)量最低,在含 IAA的培養(yǎng)液中,細(xì)胞生長(zhǎng)速度和干物質(zhì)產(chǎn)量中等,在含 NAA的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)最快,每升培養(yǎng)液收獲的干培養(yǎng)物產(chǎn)量最大[19]。在銀柴胡的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn),細(xì)胞在濃度為 0.5m g/L 6-BA及0.5m g/L 2,4-D的液體培養(yǎng)基中比在濃度為 1～2m g/L 6-BA及 1～2m g/L 2,4-D的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量大[20]。而對(duì)何首烏的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在 M S培養(yǎng)基中添加適量濃度的 NAA和 BA對(duì)何首烏毛狀根的生長(zhǎng)和蒽醌類化合物的合成有促進(jìn)作用[21]。所以,為了得到良好的懸浮細(xì)胞體系添加適當(dāng)配比的植物激素非常重要。

3.3 有機(jī)附加物

有機(jī)附加物對(duì)誘導(dǎo)疏松易碎的愈傷組織及其懸浮培養(yǎng)也十分重要,同時(shí)有機(jī)附加物還會(huì)影響藥用植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的生成。在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中常添加的有機(jī)物有氨基酸、肌醇及蔗糖等。氨基酸是常用的有機(jī)氮源之一,常用的氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰氨、半胱氨酸等。許多天然有機(jī)物或其制成品也可加入植物培養(yǎng)基中,如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母汁和麥芽汁等,而且比加入某種單一的氨基酸更好[22]。水解酪蛋白能顯著提高南方紅豆衫懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞培養(yǎng)的密度[23]。肌醇對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)也有一定的影響。但有人認(rèn)為,不同濃度的肌醇對(duì)半夏懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大,濃度過(guò)高可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[24]。也有研究證實(shí),肌醇能促進(jìn)龍眼胚性懸浮細(xì)胞系的分化,延緩懸浮細(xì)胞系的衰老[25]。糖類物質(zhì)是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的碳源和能源,同時(shí)又是維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需滲透壓的滲透壓穩(wěn)定劑。培養(yǎng)基中的蔗糖濃度由 2%增加到 3%時(shí),黃連懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯增長(zhǎng),但在 3%～6%的蔗糖濃度范圍內(nèi),收獲物的干重、細(xì)胞生長(zhǎng)速率未有明顯變化;當(dāng)蔗糖濃度為 7%時(shí),生長(zhǎng)速率開(kāi)始下降,說(shuō)明 3%的蔗糖濃度適合黃連細(xì)胞生長(zhǎng),未加蔗糖的對(duì)照則呈負(fù)數(shù)增長(zhǎng),這與細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制和部分細(xì)胞褐變死亡有關(guān)[26]。

4 培養(yǎng)條件對(duì)藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的影響

除培養(yǎng)材料及培養(yǎng)基之外,細(xì)胞懸浮培養(yǎng)還受其它培養(yǎng)條件的影響,如細(xì)胞培養(yǎng)的起始密度、pH值、光照、繼代周期與轉(zhuǎn)速等。

4.1 起始密度

藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞起始密度對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)影響較大。因?yàn)橹参锛?xì)胞間的聯(lián)系通常比微生物細(xì)胞的聯(lián)系密切得多,細(xì)胞要維持分裂和生長(zhǎng),其內(nèi)源代謝物質(zhì)必須達(dá)到一定的閥值,在有高密度細(xì)胞群和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富的情況下,易于達(dá)到這種閥值。而在低密度下,由于細(xì)胞少,其向外滲透的代謝物總量少,很難提高培養(yǎng)基中的代謝物濃度,因而也就很難使細(xì)胞本身存留的代謝物達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)源水平,使細(xì)胞難以分裂。因此植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)必須達(dá)到最低有效密度。在白木香懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立中就說(shuō)明,初始接種量過(guò)低會(huì)使細(xì)胞活力低,生長(zhǎng)緩慢,而接種量超過(guò)一定量時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)量也會(huì)降低,懸浮液會(huì)逐漸渾濁[16]。因此,在建立藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系時(shí),需根據(jù)不同植物細(xì)胞生長(zhǎng)特性確定最佳初始接種量。

4.2 pH值

pH值對(duì)植物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生諸多影響,包括引起質(zhì)膜通透性變化,影響物質(zhì)的吸收以及植物細(xì)胞的代謝等。有研究表明,在 pH值為 5.3和 5.8時(shí),細(xì)胞的生長(zhǎng)量基本相同,說(shuō)明細(xì)胞具有一定的自身調(diào)節(jié)能力,在一定范圍內(nèi)細(xì)胞釋放的物質(zhì)可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH至細(xì)胞生長(zhǎng)的適宜值[16]。然而細(xì)胞培養(yǎng)液 pH值隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)有明顯的變化,可能超出了細(xì)胞自身調(diào)節(jié)的范圍。在西洋參、半夏及蘆薈等藥用植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,培養(yǎng)液的 pH值會(huì)逐漸降低,通過(guò)對(duì)其動(dòng)態(tài)變化過(guò)程研究,可以人工添加適量酸堿值穩(wěn)定劑,使培養(yǎng)液pH值始終維持在有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的范圍內(nèi),從而獲得更大生長(zhǎng)量。一般藥用植物細(xì)胞生長(zhǎng)最適 pH值為5.8～6.0[27]。

4.3 光照

植物細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的生物合成受到多種內(nèi)外因子的影響,其中光強(qiáng)和光質(zhì)是環(huán)境中重要的影響因素[28]。一般植物細(xì)胞培養(yǎng)所采用的光照條件為1 500～2 000 lx,光照時(shí)間 14h/d。有學(xué)者通過(guò)研究光質(zhì)對(duì)黃芩細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響證實(shí),不同光質(zhì)對(duì)黃芩懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)、PAL(苯丙氨酸氨基裂解酶)活性和黃芩細(xì)胞中最主要的黃酮類活性物質(zhì) -黃芩苷積累有很大影響[29]。白光、紅光和藍(lán)光對(duì)懸浮培養(yǎng)黃芩細(xì)胞生長(zhǎng)具有誘導(dǎo)促進(jìn)作用,其中紅光作用最為明顯,但抑制了黃芩細(xì)胞 PAL活性和黃芩苷的積累;白光、紫外光和藍(lán)光對(duì)黃芩細(xì)胞 PAL活性和黃芩苷的積累均有增強(qiáng)作用。也有研究發(fā)現(xiàn),紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在暗培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)量是白光培養(yǎng)下的 2～3倍,紫杉醇的產(chǎn)量也是白光培養(yǎng)下的 3倍。因此,在藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)墓庹湛纱龠M(jìn)藥用植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。

4.4 繼代周期與轉(zhuǎn)速

繼代周期的長(zhǎng)短和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)也有較大影響。短的繼代周期使細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。而繼代周期過(guò)長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)含物少、液泡變大,懸浮細(xì)胞處于極度“饑餓”狀態(tài)。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線能為細(xì)胞繼代周期的確定提供重要的參考數(shù)據(jù):有關(guān)半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究中,以細(xì)胞鮮重為生長(zhǎng)指標(biāo),可以看到生長(zhǎng)曲線呈“S”型,并明顯分為延遲期、指數(shù)期和靜止期。延遲期 0～6天,細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢,指數(shù)期 6～18天,細(xì)胞增長(zhǎng)迅速,18～24天為靜止期,細(xì)胞鮮重增加幾乎停止。從其細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可得出半夏細(xì)胞培養(yǎng)的繼代周期約為 24天[30]。藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的適宜轉(zhuǎn)速的確定也非常重要,若搖床速度過(guò)高易造成對(duì)細(xì)胞傷害的剪切力;若轉(zhuǎn)速過(guò)低,不但細(xì)胞易成團(tuán),且細(xì)胞堆積,造成營(yíng)養(yǎng)“死”角,細(xì)胞得不到充足的營(yíng)養(yǎng),易衰老死亡,且轉(zhuǎn)速低使瓶?jī)?nèi)溶氧量減少,不利于細(xì)胞生長(zhǎng)[31-32]。一般轉(zhuǎn)速控制在 90～120 r/m in。

5 藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)存在的問(wèn)題

目前,在藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方面主要存在兩方面的問(wèn)題,一是細(xì)胞產(chǎn)生褐變,這也是植物細(xì)胞培養(yǎng)普遍存在的問(wèn)題。第二個(gè)是如何突破藥用植物細(xì)胞的次生代謝產(chǎn)物不高的瓶頸問(wèn)題。藥用植物進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng),它可直接用于原生質(zhì)體分離、培養(yǎng)、雜交、基因轉(zhuǎn)移、生產(chǎn)次生代謝物等,還可在短期內(nèi)在細(xì)胞水平篩選出預(yù)期突變體。但目前,藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)主要目的在于生產(chǎn)次生代謝物以供藥用。

5.1 培養(yǎng)材料的褐變

褐變是指外植體在培養(yǎng)過(guò)程中,自身組織向表面培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì),以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進(jìn)一步變褐而死亡的現(xiàn)象。在植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中褐變普遍存在,一般認(rèn)為木本植物更為嚴(yán)重,其是否能得到有效的控制是藥用植物懸浮細(xì)胞培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。褐變現(xiàn)象的影響因素較多,如基因型、外植體、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等。研究表明,應(yīng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基 M S、B5和 6,7-V能有效減少藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中發(fā)生褐變現(xiàn)象[33]。細(xì)胞培養(yǎng)中所用激素對(duì)不同愈傷組織和細(xì)胞的作用是不一樣的,對(duì)褐變的影響也不相同。在紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中,生長(zhǎng)素類中有關(guān) 2,4-D和 NAA這兩種激素對(duì)褐變的影響研究較多。一種結(jié)果認(rèn)為,2,4-D優(yōu)于 NAA,另一種結(jié)果則認(rèn)為 NAA優(yōu)于 2,4-D,但鑒于 2,4-D本身的致癌活性,紅豆杉要作為藥源,1.0m g/L NAA+0.5m g/L 6-BA是替代 2,4-D的適宜組合[34]。

5.2 次生代謝產(chǎn)物的提高

一般促進(jìn)次生代謝物生成的方法有以下幾種:添加誘導(dǎo)子,前體飼喂,兩相培養(yǎng),培養(yǎng)條件調(diào)控。誘導(dǎo)子是一種能引起植物過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì),由于它在與植物的相互作用中,能快速、高度專一和選擇性的誘導(dǎo)植物特定基因的表達(dá),進(jìn)而活化特定次生代謝途徑,積累特定的目的次生代謝物,所以可以利用它來(lái)提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。目前應(yīng)用最廣、研究最多的是真菌誘導(dǎo)子,例如戴均貴等[35]報(bào)道從 10種真菌誘導(dǎo)子中篩選出效果較好的日本根霉誘導(dǎo)子,當(dāng)以濃度為5m g/L添加到銀杏(Ginkgo biloba L)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系中,誘導(dǎo)培養(yǎng) 3天時(shí),懸浮細(xì)胞的銀杏內(nèi)酯 B(GKB)產(chǎn)量比對(duì)照增加約 1倍。前體飼喂是在植物細(xì)胞培養(yǎng)中加入次生代謝物生物合成的前體,這種方法在許多培養(yǎng)細(xì)胞中都取得了很好的效果。有學(xué)者在脹果甘草細(xì)胞懸浮體系中加入苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙酸鈉四種前體,結(jié)果顯示四種前體在合適的濃度下對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的抑制作用,而且均能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)甘草黃酮的生物合成[36]。兩相培養(yǎng),是指在植物細(xì)胞培養(yǎng)中加入水溶性或脂溶性的有機(jī)物,或者是具有吸附作用的多聚化合物,使培養(yǎng)體系由于分配系數(shù)的不同而形成上下兩相,細(xì)胞在其中一相中生長(zhǎng)并合成次生代謝物,而這些產(chǎn)物又通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)運(yùn)輸方式釋放到細(xì)胞外,并被另一相所吸附。該法可減輕產(chǎn)物本身對(duì)細(xì)胞代謝的抑制作用,并可保護(hù)產(chǎn)物免受培養(yǎng)基中催化酶或酸對(duì)產(chǎn)物的影響。調(diào)控培養(yǎng)條件也是提高藥用植物次生代謝產(chǎn)物的有效辦法,如根據(jù)不同種類的植物選擇合適的光照、培養(yǎng)溫度等。

6 結(jié)語(yǔ)

藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系建立的影響因素有很多,雖然目前已有大量相關(guān)研究,但仍存在問(wèn)題需要解決。首先,藥用植物作為一種具特殊用途的植物,除借鑒常規(guī)植物的培養(yǎng)方法外還需結(jié)合用藥的方法理論進(jìn)行考慮,在獲得良好的細(xì)胞培養(yǎng)體系的同時(shí)促進(jìn)其有效成分的生成,抑制非有效物質(zhì)的產(chǎn)生,以達(dá)到有效藥用資源的最大化。其次,就是藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)?；媾R的問(wèn)題,要進(jìn)一步獲得大量的藥用植物有效成分就必須進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),但目前能進(jìn)行量化生產(chǎn)的藥用植物只有少數(shù)幾種,原因之一就是細(xì)胞增殖率不高,產(chǎn)物不穩(wěn)定,可考慮通過(guò)生物技術(shù)改造植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)以提高藥用植物細(xì)胞增殖率及其次生代謝物。同時(shí)進(jìn)一步探索各因素對(duì)藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)的影響,根據(jù)具體藥用植物細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件,以達(dá)到操作簡(jiǎn)便、懸浮系優(yōu)良的目標(biāo),為最終獲得可代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥用植物的優(yōu)質(zhì)中藥資源奠定基礎(chǔ)。

[1] 鐘建江,沈林南,王斯靖.植物細(xì)胞培養(yǎng)工程的最新進(jìn)展[J].工業(yè)微生物,1995,25(1):25-29.

[2] 李冬杰.藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].河北林業(yè)科技,2003,24(4):22-23.

[3] 楊慶仙,王春霞.杜仲細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)[J].中國(guó)林副特產(chǎn),2005,10(5):17-18.

[4] 張麗平,梁玉玲,許恒飛.脹果甘草細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)[J].河北大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(6):659-663.

[5] 羅成科,彭正松,陳衛(wèi)民.三葉半夏懸浮培養(yǎng)下的體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生[J].西北植物學(xué)報(bào),2006,26(4):0842-0846.

[6] 肖天劍,李興林,蔡津,等.烏拉爾甘草懸浮單細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)[J].天津科技大學(xué)學(xué)報(bào),2009,24(6):5-8.

[7] 張國(guó)柱,王侖山,潘有福,等.植物體細(xì)胞胚發(fā)生的同步控制 I.枸杞細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1994,30(4):88-91.

[8] 丁婷,馬慶,項(xiàng)艷.紅景天愈傷組織的誘導(dǎo)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2008,24(5):224-227.

[9] 李學(xué)棟,龔真才,馬勇,等.不同培養(yǎng)條件對(duì)益母草懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[J].西華師范大學(xué)學(xué)報(bào),2008,29(2):136-140.

[10] 范美華,周吉源.不同條件對(duì)半夏懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)及總生物堿形成的影響[J].云南植物研究,2004,26(6):656-660.

[11] 李健,宋曉平,陳樹(shù)林.紅豆杉屬植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)影響因素研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2005,33(10):42-45.

[12] 白茗洲,柳旭,張小燕,等.白木香細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(31):15150-15152.

[13] 張東向,李康,張磊,等.不同理化因子對(duì)黃芩懸浮細(xì)胞系的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(5):1266-1268.

[14] 楊芳,孫磊,王繼花,等.促進(jìn)丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和水溶性酚酸含量的因素[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報(bào),2008,33(3):96-99.

[15] 梁軍,魏剛,呂全.印楝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立及懸浮培養(yǎng)[J].林業(yè)科學(xué)研究,2003,16(5):568-574.

[16] 元英進(jìn),葛志強(qiáng).植物細(xì)胞培養(yǎng)工程[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:13.

[17] 盛長(zhǎng)忠,王淑勞,王寧寧,等.南方紅豆杉愈傷組織織培養(yǎng)的研究[J].中草藥,2000,31(2):130-132.

[18] 彭金環(huán),于元杰,張美珍.輪葉黨參的組織培養(yǎng)及植株再生研究[J].西北植物學(xué)報(bào),2010,30(1):0184-0189.

[19] 尹作鴻,朱蔚華.雷公藤愈傷組織懸浮培養(yǎng)的研究[J].生物工程學(xué)報(bào),1992,8(1):95-98.

[20] 鄧光存,彭勵(lì),楊彩榮,等.不同激素對(duì)銀柴胡細(xì)胞生長(zhǎng)及營(yíng)養(yǎng)成分消耗的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,2006,24(16):107-111.

[21] 于榮敏,馬娜,嚴(yán)春艷,等.外源激素對(duì)何首烏毛狀根生長(zhǎng)及蒽醌類成分生物合成的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2006,22(4):619-623.

[22] Tzer Miin Chong,Mohd A Abdtfllah,Oi Ming Lai.Effective elicita-fion factors in Morinda elliptica cellsuspension ctflture[J].Process Biochemistry,2005,40(11):3397-3405.

[23] 胡萍,李淑穎,元英進(jìn),等.南方紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),1997,11(4):30-35.

[24] 范美華,馮玲玲,彭瑜.幾種營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)半夏懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及總生物堿形成的影響[J].華中師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,38(4):193-496.

[25] 賴鐘雄,陳振光.龍眼胚性細(xì)胞懸浮培養(yǎng)再生植株[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2002,8(5):485-491.

[26] 毛堂芬,顏謙,方周伯.蔗糖和硝酸銨對(duì)黃連懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和小檗堿含量的影響[J].生物技術(shù),1994,4(3):33-35.

[27] 閆靜輝,張小兵,李春生,等.西洋參懸浮細(xì)胞系的建立及其生長(zhǎng)特性的研究[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào),2005,22(4):23-26.

[28] Xie L L,Zhao W L,Shen L M.Lightregulation of the expression of PAL gene in soybean leaves andisoflavone synthesis[J].Chin Bull Bot,2000,17(5):443-449.

[29] 張進(jìn)杰,徐茂軍,周桂飛.光質(zhì)對(duì)懸浮培養(yǎng)黃芩細(xì)胞生長(zhǎng)及黃芩苷積累的影響[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2007,15(2):135-140.

[30] 范美華.半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和次生代謝物提取的初步研究[D].武漢:華中師范大學(xué),2004:35.

[31] 葉國(guó)洪,穆虹,徐鳳彩.培養(yǎng)條件對(duì)煙草細(xì)胞牛長(zhǎng)和 CoQ10含量的影響[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(2):42-45.

[32] HO CW,Jian WT,Lai IIC.Plant regeneration viasore atic embryogen-esis from suspension cell cultures of Lilium x formolongi Hort using a bioreactor system[J].In Vitro Cellular&Develo-pment Biology plant,2006,42(3):240-246.

[33] 張進(jìn)獻(xiàn),魏景芳,李宏杰,等.藥用植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)中的褐變問(wèn)題[J].河北林業(yè)科技,2007,35(5):42-44.

[34] 李冬杰,魏景芳,張進(jìn)獻(xiàn),等.激素對(duì)紅豆杉愈傷組織生長(zhǎng)和褐化的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2004,19(增刊):62-64.

[35] DAIJG,ZHU WH,WUY Q,et al.Effects of precursors andfungal elicitors on GKB production in suspension cultured cells of Ginkgobil-oba L[J].Acta Pharm Sin,2000,35(2):151-155.

[36] 楊英,何峰,季家興,等.四種前體對(duì)脹果甘草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)甘草黃酮的調(diào)控效果評(píng)價(jià)[J].武漢植物學(xué)研究,2007,25(5):484-489.