三維成球培養(yǎng)優(yōu)化間充質干細胞的研究進展

梁 瑜，喬 勇，劉星志,3，徐中娟,3，朱小立,索廣力

(1.上海大學生命科學學院，上海 200444)(2.中國科學院蘇州納米技術與納米仿生研究所，江蘇 蘇州 215123)(3.中國科學技術大學納米技術與納米仿生學院，安徽 合肥 230026)

1 前 言

間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)來源于發(fā)育早期的中胚層，是具有高度自我更新能力和多向分化潛能的間質細胞，屬于多能干細胞。MSCs最初在骨髓[1]中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)研究證實其廣泛存在于多種組織器官中，包括骨髓、脂肪、臍帶血、羊膜、胸腺、牙髓、外周血、臍帶等[2-4]。在體內或體外特定的誘導條件下，MSCs可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內皮等多種組織細胞[5, 6]，經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。同時，研究發(fā)現(xiàn)將MSCs作為細胞治療的介質是安全且不具有潛在危險的，這為MSCs的廣泛應用提供了堅實的基礎[7-10]。MSCs因具有來源廣泛、有多向分化潛能、免疫調控和自我更新等特點而日益受到人們的關注。截止到目前，MSCs已被廣泛應用于移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)、再生障礙性貧血、急性心梗、肝損傷、腦卒中、骨發(fā)育不全、肌萎縮側索硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、克隆氏病、中風、糖尿病、糖尿病足、肝硬化、關節(jié)炎、支氣管肺發(fā)育不全、脊髓損傷等多種疾病[11-28]的治療，并獲得了明顯的治療效果。截止到2020年3月，全球登記在冊的 MSCs用于治療的臨床試驗為1070例，我國為246例[29]。

雖然MSCs被廣泛應用于不同疾病的治療，并表現(xiàn)出鮮明的優(yōu)勢，但在應用中仍面臨諸多問題：如臨床細胞的大量需求難以滿足、細胞質量的異質性、移植后體內存活能力差、體外2D貼壁培養(yǎng)造成MSCs特征變異和其治療疾病的具體機制未知等。

其中，最現(xiàn)實的問題就是如何在體外培養(yǎng)出足夠數(shù)量且優(yōu)質的MSCs以滿足臨床需求。臨床治療中，MSCs的需求量為0.5×106～2×106kg-1，一般輸入治療4～8次，按平均體重75 kg和治療6次計算，單個病人的細胞需求總數(shù)量達到4.5×108個，需要獲取足夠量的原代MSCs并進行多次體外傳代(可能達到10次以上)才能滿足[30-33]。目前，傳統(tǒng)的2D貼壁培養(yǎng)方式仍為MSCs體外快速培養(yǎng)的主要方式。研究證明，隨著傳代次數(shù)的增加和培養(yǎng)時間的延長，MSCs會逐漸減弱甚至喪失分化和旁分泌能力，其生物學特性可能發(fā)生根本變化[34, 35]。由于以上問題，MSCs注入機體后還會面臨或導致其他諸多問題：① 細胞的存活能力差，不能有效地忍耐機體中的各種脅迫，諸如缺氧、營養(yǎng)不足和血液懸浮造成的失巢凋亡(anoikis)等；② 大量活力差或凋亡的細胞注入機體導致炎癥和不良免疫反應；③ 不能有效抑制T細胞的殺傷作用，不能有效分泌各種有益的細胞因子和生長因子，以提高機體的免疫力；④ 細胞的特有干細胞特性喪失，從而失去某些特有的損傷修復功能。所以，在體外擴增足夠多MSCs的同時，又能保證其活力和主要的生物學特性不發(fā)生變化，是急需解決的科學問題。

生物體內的細胞是在3D的立體微環(huán)境中生長的，雖然2D培養(yǎng)可以快速增殖MSCs，但并不是細胞生長的天然狀態(tài)，培養(yǎng)微環(huán)境與機體內微環(huán)境差異太大，會影響細胞的基因表達、信號轉導等，導致所培養(yǎng)的細胞逐漸喪失其在生物體內的生物學特性及功能，還會導致細胞在分化能力和活力等方面的異質性[34, 35]。3D培養(yǎng)技術的應用，為細胞在體外培養(yǎng)的過程提供了一個更加接近體內生存條件的微環(huán)境，更有利于細胞的增殖、存活以及本身特性的保持。與傳統(tǒng)的2D貼壁培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)形成球狀細胞聚集體(multicellular spheroid, MCS)，被認為是模擬更真實的機體內生存環(huán)境。3D培養(yǎng)細胞球已經(jīng)被廣泛應用于干細胞臨床醫(yī)學和再生醫(yī)學研究等領域，并在許多體外實驗及臨床前動物研究中顯示出良好的效果[36-38]。

本文對MSCs體外3D成球培養(yǎng)的方法進行了總結，并綜述了3D成球培養(yǎng)對MSCs生物學特性和功能的影響。針對MSC 3D成球培養(yǎng)在應用中急需解決的具體問題及其優(yōu)化干細胞的生物學機理的研究進行了討論和展望。

2 3D成球培養(yǎng)的MSCs的生物學特性

對細胞進行3D成球培養(yǎng)時，這種在體外生長的過程更加接近體內生存條件的微環(huán)境，因而更有利于細胞的增殖和存活以及本身特性的保持。相較于2D培養(yǎng)的細胞，3D成球培養(yǎng)的MSCs在生物學特性和功能方面會發(fā)生巨大變化。

2.1 細胞的形態(tài)和性狀發(fā)生改變

形態(tài)上，3D培養(yǎng)的細胞不再二維貼壁生長，而是立體成球，細胞核較大而細胞體積明顯縮小，僅為貼壁培養(yǎng)時細胞體積的約1/4，因此在靜脈注射細胞時，細胞肺栓塞幾率降低，經(jīng)過心、肝、脾、腎的細胞數(shù)量增加了25%[39]。

細胞形態(tài)發(fā)生變化，細胞骨架也隨之改變。3D培養(yǎng)的細胞其細胞球周圍生成的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)比2D培養(yǎng)的細胞要多[40]。細胞中的整合蛋白和ECM相互作用形成聚集體，然后通過介導細胞間粘附的鈣黏蛋白建立連接，使細胞重構成球[41, 42]。

2.2 細胞存活能力增強

當細胞成球培養(yǎng)時，細胞增殖緩慢，細胞的抗凋亡和抗衰老能力增強。Qiao[43]等研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡標志物Cleaved Caspase-3相較于2D培養(yǎng)的細胞表達水平降低。當恢復成貼壁培養(yǎng)時，衰老相關的基因表達水平降低，增殖能力增強。在缺氧條件下，缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的表達量升高，早期凋亡的細胞數(shù)量較少。Cheng等[44]研究也發(fā)現(xiàn)3D成球培養(yǎng)中抗凋亡基因 Bcl-2高表達、促凋亡基因 Bax低表達，使得MSCs壽命增加并延緩衰老。Lee等[45]在小鼠缺血的肢端組織中分別皮下注射入成球培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的MSCs，對比發(fā)現(xiàn)MSCs細胞球在小鼠體內移植區(qū)的增殖能力比相應2D培養(yǎng)的細胞增殖能力更強。

2.3 MSCs抗炎癥和旁分泌能力增強

大量研究表明，MSCs成球培養(yǎng)可以增強細胞的抗炎癥和免疫調節(jié)能力以及旁分泌能力。懸滴法制備的人骨髓間充質干細胞球，其分泌斯氏降鈣素1(Stanniocalcin-1，STC-1)和腫瘤壞死因子α誘導蛋白6(TNF-stimulated gene 6 protein，TSG-6)的能力得到增強[39]。將細胞球注射入小鼠腹膜炎模型中，檢測發(fā)現(xiàn)炎癥標志物如白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等表達水平均顯著降低。Li等[41]研究發(fā)現(xiàn)MSCs細胞球旁分泌的多種細胞生長因子與貼壁培養(yǎng)的MSCs相比均有增加， 其中肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和轉化生長因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)的旁分泌能力顯著優(yōu)于單層貼壁培養(yǎng)的MSCs。通過成球培養(yǎng)，增強了人脂肪來源的間充質干細胞(human adipose tissue derived mesenchymal stem cells，hADMSCs)的存活和旁分泌能力，進而促進缺血組織的血管生成，提高治療效果[46]。與單層培養(yǎng)相比，成球培養(yǎng)的細胞能更有效地適應低氧環(huán)境，上調缺氧適應信號(即基質細胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1α)和HIF-1α并抑制凋亡，促進血管生成和抗凋亡因子(即肝細胞生長因子、血管內皮生長因子和成纖維細胞生長因子2)的分泌。

2.4 MSCs自我更新能力和多向分化潛能增強

3D成球培養(yǎng)可以維持MSCs干性，通過提高MSCs的多潛能相關基因Nanog的表達，來增強細胞的多向分化潛力[47, 48]。Cheng等[44]研究也發(fā)現(xiàn)，與貼壁培養(yǎng)的MSCs相比，3D成球培養(yǎng)的MSCs細胞球中 Nanog、Sox-2、POU5FI/OCT4等多能干細胞標記物的表達顯著增強，證明了3D成球培養(yǎng)可增強MSCs的多向分化潛能。

3 體外3D成球培養(yǎng)的方法

3.1 多細胞聚集式3D成球培養(yǎng)的方法

目前報道的3D成球培養(yǎng)大多是利用細胞聚集成團形成球狀細胞聚合體，并在3D環(huán)境中增殖培養(yǎng)形成3D細胞球。這里介紹其中幾種典型的干細胞3D成球培養(yǎng)方法。

3.1.1 懸滴法3D培養(yǎng)干細胞球

Foty[49]報道了3D培養(yǎng)干細胞球的懸滴法。首先將細胞液滴加在組織培養(yǎng)皿皿蓋內部，每一滴的體積為15～30 μL，包含300～3000個細胞。翻轉培養(yǎng)皿皿蓋，懸滴因表面張力會懸掛在培養(yǎng)皿皿蓋上，重力作用下，懸滴中的細胞彼此間直接接觸且與細胞外基質接觸，在懸滴底部形成單一球體，之后在生理條件下培養(yǎng)，直至形成真正的3D球狀體。Kelm等[50]將孔板的每個孔結合特異性抗體，該抗體可特異性結合血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，然后把人主動脈成纖維細胞(human aortic fibroblasts，HAF)以梯度濃度接種到每個孔中，并將平板倒置以形成懸滴和細胞球。之后除去培養(yǎng)基和細胞球，使用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和顯色讀數(shù)以定量基于細胞球的VEGF產(chǎn)生。(圖1)。這種方法不需要特殊的設備，能夠生產(chǎn)特定大小、具體細胞數(shù)量的球體，可用于測量生物力學性質或用于生理學相關模型中的分子和生物化學分析，但是難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

圖1 懸滴法三維培養(yǎng)干細胞球[50]Fig.1 A hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids[50]

3.1.2 微圖案法3D培養(yǎng)干細胞球

Wang等[51]報道了基于光刻和微圖案化技術進行3D成球的培養(yǎng)方法。首先在玻璃板上涂覆膠原蛋白和聚乙二醇，接著在基質區(qū)域上形成大小一致的微圖案孔，從而制備出尺寸精確、質量均勻的MSCs球體，然后誘導分化為脂肪細胞和成骨細胞。基因芯片分析表明，3D球體培養(yǎng)體系誘導的MSCs分化效率高，不僅可以上調成脂、成骨相關基因的表達水平，還可以通過下調維持MSCs自我更新能力的基因來調控基因表達。光刻的圖案還能根據(jù)實際需要進行變化。該方法獲得的球體大小較為一致，但制作較為復雜，獲得的細胞數(shù)量較少。

3.1.3 低吸附表面培養(yǎng)法3D培養(yǎng)干細胞球

該方法主要是將細胞接種在本身吸附力較低的培養(yǎng)皿或孔板中，或者通過在培養(yǎng)器皿上覆蓋低粘附的聚合物涂層使細胞懸浮成球[52]。該方法簡單，但獲得的細胞球大小不一致，成球質量不高，細胞球大小受細胞接種密度影響，成球形狀因細胞種類的不同而改變。

3.1.4 動態(tài)懸浮法3D培養(yǎng)干細胞球

為了獲取大量的細胞球，研究者們開始利用生物反應器進行細胞培養(yǎng)，其類型包括攪拌式生物反應器[53]、旋轉式生物反應器[54]、灌流式生物反應器[55]及中空纖維膜反應器[56]等。反應器的優(yōu)點是可以獲取足夠數(shù)量的細胞、反應參數(shù)可以調節(jié)。但是攪拌式和旋轉式反應器中產(chǎn)生的機械剪切力和培養(yǎng)基泡沫對細胞有損傷，采用灌流式反應器時細胞分泌因子和營養(yǎng)流失較為嚴重。它們共同的缺點是，細胞成球形狀和大小不可控，細胞異質性嚴重。

3.1.5 殼聚糖膜等基質介導法3D培養(yǎng)干細胞球

臺灣大學高分子科學與工程研究所的黃國祥等[57]通過殼聚糖膜法3D培養(yǎng)干細胞球。首先在殼聚糖膜和使用透明質酸(hyaluronan，HA)進一步修飾的殼聚糖膜(殼聚糖-HA)上培養(yǎng)從人類脂肪組織來源成體干細胞(human adipose tissue derived adult stem cells, hADAS)和人胎盤間充質干細胞(human placenta tissue derived mesenchymal stem cells, hPDMC)中分離的MSCs，將hADAS和hPDMC(每種細胞3×104個)接種在24孔組織培養(yǎng)板中的每個膜上。觀察到兩種來源的MSCs形成3D球狀體與MMP-2表達增加有關，且殼聚糖-HA上的細胞形成球狀體更快，球狀體的尺寸大于單獨的殼聚糖(圖2)。同時，發(fā)現(xiàn)在殼聚糖膜和殼聚糖-HA膜上形成粘附的球狀體可以更好地維持MSCs的干細胞特性標記基因的表達，并增加它們的軟骨分化能力，可作為軟骨組織工程的新細胞來源。球體形成的調節(jié)機制依賴于Rho/Rho相關激酶(Rho/Rho-associated kinase，ROCK)，值得進一步研究。不過該方法獲得球體的效率不高，球體形狀不統(tǒng)一。

圖2 殼聚糖膜法三維培養(yǎng)干細胞球[57]Fig.2 Spheroid formation of mesenchymal stem cells on chitosan and chitosan-hyaluronan membranes[57]

3.1.6 微流體法3D培養(yǎng)干細胞球

杜克大學生物醫(yī)學工程系的Chan等[58]使用微流體法3D培養(yǎng)干細胞球。微流體與支架的整合被認為是一種有前景的體外培養(yǎng)MCSs新方法，因為它不僅可以受控產(chǎn)生尺寸均勻的MCSs，還可以恢復細胞-細胞之間以及細胞-基質之間的相互作用，該相互作用對MCSs形態(tài)和功能至關重要。微流體裝置主要由兩根微米級通道組成，一根提供持續(xù)流動包含細胞的水相液體，另一根提供持續(xù)流動的油相液體。將包含細胞的水相液體通入油相液體中，由于水油不相容，在流動的油相液體中生成含細胞的水相微球，微球中的細胞聚集在一起形成多細胞球。通過控制動態(tài)參數(shù)，微流體裝置可控制細胞在微米級通道內的流動，創(chuàng)造出獨特的環(huán)境以滿足多細胞球體的生產(chǎn)要求(圖3)。這種方法還可以通過減少剪切應力來減小細胞損傷，其中的微流室可以控制多細胞球體的尺寸。而支架提供的物理基質支持可以促進MCSs分秘ECM。該方法還能夠調節(jié)MCSs形成和生長的微環(huán)境以模擬體內條件，而且具有商業(yè)化的潛力。這種基于液滴的方法能夠快速生產(chǎn)多細胞球體，且效率高，唯一的不足就是需要特定的設備。

多細胞成球的培養(yǎng)方法還有很多。例如借助外力作用使細胞成球的方法，通過離心法使細胞成團進而聚集生長成球，球體通常較大，核心區(qū)域缺氧，這種方法臨床應用較少，但適用于研究骨再生[59]。細胞裝載磁性納米顆粒通過磁場誘導使細胞聚集成球[60]，可用于闡明細胞-細胞之間的相互作用和研究藥物傳遞基質，但引入外來材料涉及材料的代謝時程和安全性問題，不適用于臨床治療，且細胞尺寸不可控，無法避免外力對細胞的損傷。基于表面聲波技術的3D聲學鑷子也可以用于制備多細胞球體，該方法可以連續(xù)制造150多種尺寸可控的球體，同時每30 min可將細胞球轉移到培養(yǎng)皿中。該技術可實現(xiàn)快速高通量，但需要特殊設備[61]。

圖3 微流體法三維培養(yǎng)干細胞球[58]：(a，b)在兩個流動聚焦裝置中形成水-油和水-油-水乳劑；(c)包封在液滴中的細胞組裝形成單個球狀體，隨后可以在有或沒有微凝膠包封的情況下釋放；(d)收集后在100 μm通道寬度的裝置中產(chǎn)生的液滴，紅色箭頭表示作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的空油滴；(e)不同染料包裹在液滴中的擴散曲線，圖例中提供了染料的分子量(MW)和分配系數(shù)(PC)；(f)內部水相流速固定2 μL/ min，通過改變油相流速(n≥30)來控制液滴的核心尺寸Fig.3 Three-dimensional culture of spheroids generation by microfluidic[58]: (a, b) Formation of w/o and w/o/w emulsions in two flow-focusing devices; (c) Schematic diagram showing how droplets are generated and spheroids are formed. Cells encapsulated in droplets assemble to form a single spheroid, which can be subsequently released with or without microgel encapsulation; (d) The appearance of droplets generated in device with 100 μm channel width after collection. The red arrow indicates an empty oil droplet generated as side product; (e) Diffusion curve of different dyes encapsulated in droplets. Molecular weight (MW) and partition coefficient (PC) of the dyes are provided in the legend; (f) Size of core of droplets controlled by fixing inner aqueous phase flow rate at 2 μL/min and altering oil phase flow rate (n≥30)

多細胞聚集3D成球培養(yǎng)有一個明顯的缺陷，就是多個質量良莠不齊的細胞聚集的3D培養(yǎng)無法對細胞的質量異質性起到篩選的作用。另外，在尺寸不可控的較大3D細胞球中，不同部位的細胞會由于營養(yǎng)的不均衡導致質量的異質性，比如在細胞球中心部位的細胞，因缺少營養(yǎng)、缺氧和失巢凋亡而衰老、凋亡或變異等。

3.2 單細胞3D成球培養(yǎng)的方法

最近的研究報道了一種新穎的、基于細胞芯片單MSCs 2D陣列和3D培養(yǎng)的單細胞來源細胞球培養(yǎng)方式，可顯著地優(yōu)化臍帶間充質干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)的質量。作者團隊和中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所的戴建武實驗室合作，通過細胞芯片使單細胞和可控數(shù)量的多細胞分別形成2D陣列，并結合細胞3D培養(yǎng)技術，創(chuàng)新性地發(fā)展了一種可大量生產(chǎn)單細胞來源細胞球(single cell derived sphere， SCDS)和可控的多細胞來源細胞球(multiple cell derived spheroid，MCDS)的方法(圖4)，建立SCDS和均一MCDS的生產(chǎn)體系[43]。在該研究中，大量的實驗數(shù)據(jù)證明，與2D和MCDS相比，用SCDS培養(yǎng)UCMSCs對間充質干細胞特征維持、細胞遷移、存活、抗衰老和脅迫耐受等方面有顯著的優(yōu)化作用。動物實驗的數(shù)據(jù)顯示，用SCDS培養(yǎng)UCMSCs可以顯著增加異種移植體內的血管生成量。在小鼠急性肝損傷動物模型中，SCDS培養(yǎng)的UCMSCs表現(xiàn)出更好的歸巢能力和創(chuàng)傷組織修復能力。

顯然，相較于2D和MCDS細胞培養(yǎng)，SCDS培養(yǎng)對UCMSCs在細胞治療中有非常顯著的優(yōu)化作用，其主要原因在于：① SCDS細胞培養(yǎng)是以干細胞自我更新能力為標準和理論依據(jù)來優(yōu)化UCMSCs，干細胞的自我更新能力表現(xiàn)為單個細胞的增殖能力，單細胞芯片上單細胞2D陣列結合3D細胞培養(yǎng)技術獲得的SCDS，既是對細胞自我更新能力的篩選，也是對細胞自我更新能力的馴化和恢復；② 通過篩選和馴化，SCDS培養(yǎng)的UCMSCs在細胞活力和生物學特性方面實現(xiàn)均一化，部分地消除了細胞的異質性；③ SCDS的尺寸較小，通常在50 μm以下，可以不通過酶解，直接用于機體注射； ④ 與MCDS相比，SCDS中的單細胞具有較好的均一性，每個細胞所處的微環(huán)境較為一致；⑤ 與2D培養(yǎng)的細胞相比，SCDS球體表面有基質保護，使細胞更易于抵抗不利的生存環(huán)境，如酸、堿、酶解、缺氧和缺營養(yǎng)等；⑥ 與2D培養(yǎng)的細胞相比，SCDS的離散度更高，利于細胞在機體內的運輸和分布并減少細胞聚集；⑦ SCDS培養(yǎng)的細胞更易進入G0期并促進AMPK的激活，利于細胞保持干細胞特性、抵抗不利生存環(huán)境；⑧ 由一個細胞分裂出的幾個子細胞在一個有限的發(fā)育環(huán)境中有機地相互作用，有利于形成功能單位，并易于在體內較快地行使功能；⑨ SCDS在不良生存環(huán)境中的耐受性可能使其更好地應用于3D生物打印和類器官構建研究；⑩ 細胞芯片生產(chǎn)的細胞球具有細胞數(shù)可控和均一化特征，易于在生產(chǎn)中實現(xiàn)標準化。

圖4 三維培養(yǎng)單細胞來源干細胞球[40]：(a)細胞芯片的制備和3D培養(yǎng)形成SCDS的流程圖；(b，c)細胞芯片上SCDS和MCDS的表征，UCMSCs培養(yǎng)形成的2D、MCDS和SCDS細胞進行雙染實驗獲得的代表性照片；(d)SCDS培養(yǎng)0～7天的的熒光圖，細胞核被Hoechst 33342染成藍色；(e)用散點圖統(tǒng)計最初接種在直徑為100μm孔上粘附的細胞數(shù)；(f)統(tǒng)計培養(yǎng)2～7天形成MCDS時的細胞球尺寸；(g，h)用散點圖統(tǒng)計培養(yǎng)1～7天形成SCDS的細胞數(shù)、細胞球尺寸，n=20Fig.4 Three-dimensional culture of single cell-derived stem cell spheres[40]: (a) The scheme of cell chip fabrication and SCDS formation in 3D culture; (b, c) The characterization of SCDS and MCDS on cell chips, epresentative images of double staining experiment using 2D, MCDS and SCDS cultured UCMSCs; (d) The fluorescent images of SCDS from 0 day to 7 days, the nuclei of cells were stained by Hoechst 33342 as blue color; (e, f) The scatter diagram of initial cell number on one 100 μm diameter of patch and diameter of MCDS cultured from 2 to 7 days; (g, h) The scatter diagram of cell number within one SCDS and diameter of SCDS cultured from 1 day to 7 days, n=20

4 3D成球培養(yǎng)優(yōu)化MSCs的展望

3D培養(yǎng)的細胞球較2D培養(yǎng)的細胞在存活、因子分泌、干細胞特性保持、遷移、抗衰老、抗炎和血管生成等方面有較大的優(yōu)勢，預示著其在未來的組織創(chuàng)傷修復的臨床應用中有很好的前景。但是，也面臨諸多的問題。

4.1 MSCs成球制備方法的局限性

雖然目前傳統(tǒng)3D成球方法制備的多細胞球體具有眾多優(yōu)勢，但是明顯的缺陷限制了多細胞球體在研究和治療領域的應用。首先，多細胞球體是由多個活力上有差異的細胞混合形成的球體，細胞的質量存在較大的異質性。其次，尺寸較大的多細胞球體內部存在營養(yǎng)物質、氧氣和廢棄物代謝等差異，球體中心的細胞很難獲得足夠的營養(yǎng)物質和氧氣條件，產(chǎn)生的廢棄物也很難及時代謝到環(huán)境中，影響了基因表達水平，甚至可能導致基因突變，從而影響細胞的質量。而且，多細胞球體中心的細胞由于缺少細胞外基質的支撐，易發(fā)生失巢凋亡。此外，損傷的細胞在體內可能引起不良的免疫反應。因此，需要獲得便于均一化、標準化，能夠進行質量控制和評估的制備方法，同時還需要能夠大量生產(chǎn)以滿足臨床需要。作者團隊建立的單細胞來源成球(SCDS)的培養(yǎng)方法，可以對單個細胞進行質量的篩選和馴化，在一定程度上實現(xiàn)了質量的均一性。但在未來，該方法需要優(yōu)化工藝，攻克3D培養(yǎng)生物材料制備和細胞球自動化規(guī)模生產(chǎn)的難題。

4.2 需要深入研究3D成球培養(yǎng)優(yōu)化MSCs的機理

在以往的治療模型中，通過細胞因子、缺氧、營養(yǎng)不良培養(yǎng)基/雷帕霉素誘導劑誘導自噬、熱休克、氧化應激或化學物質對MSCs進行預處理，可以促進移植后的細胞存活或功能[62]。用IL-1β和/或干擾素-γ預處理骨髓間充質干細胞可以提高其對直接葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導的結腸炎的治療效果[63]。3D成球培養(yǎng)的MSCs對細胞存活和抗炎癥也有促進作用，因此研究3D成球MSCs模型的生物學特性及其在不同病理條件下發(fā)揮治療作用的機制可以為今后的臨床應用提供指導。

目前已有大量的研究對MSCs成球機理進行探索，但仍然不夠全面。需要引入先進的生物學技術如單細胞測序分析等，加強分子生物學水平的機理研究，從細胞信號轉導、能量代謝、微環(huán)境調控、表觀遺傳調控等方面進行解析，找到參與干細胞優(yōu)化的關鍵調控因子和通路等。深入的機理研究將有助于：① 建立干細胞優(yōu)化評估標準；② 篩序優(yōu)化干細胞的小分子化合物，探索出優(yōu)化MSCs的新方法；③ 標準化臨床治療方法等。

4.3 協(xié)同MSCs球作用的生物材料研究

1999年，Horwitz等[64]利用骨髓間充質干細胞成功治療了3個嬰兒成骨不全的病例，并在臨床上初次驗證了MSCs可以異體移植且分化融入異體中，此后出現(xiàn)了越來越多的臨床應用。不同的臨床癥狀需要使用不同的干細胞治療方式。

當治療需要進行體內血管注射入細胞時，細胞球的尺寸要小，對細胞的歸巢能力及均一化要求較高；在組織重塑和表面修復時，可以進行局部注射。相較于貼壁培養(yǎng)的細胞，細胞球更適合作為種子細胞結合生物材料進行組織工程類的修復。而尋找合適的支架材料，調節(jié)細胞球與支架材料的接種密度、作用比例顯得尤為重要。此外 ，對生物支架的降解能力、彈性模量、空間孔隙大小及組織相容性都需要進行考慮。另外，還可以利用水凝膠等支架材料模擬干細胞生長的微環(huán)境(細胞因子、理化信號的刺激及力學刺激)，使干細胞球更好地發(fā)揮作用。還可以構建復合型的功能材料，模擬微血管系統(tǒng)，使其在體內發(fā)揮更好的治療效果。

5 結 語

MSCs細胞球在體外和體內的生物學特性證實了3D成球培養(yǎng)對MSCs的優(yōu)化作用，顯示了其在再生醫(yī)學和組織工程臨床應用中的巨大應用潛力。3D細胞球整合了細胞-細胞以及細胞-基質間的相互作用，對其深入研究，有助于了解體內組織間相互作用的機制，為生物組織工程的研究提供理論依據(jù)。干細胞的臨床應用還處于初始階段，需要建立健全有效的質量評估體系，研發(fā)新的方法和工藝，針對特定的臨床需求，大規(guī)模生產(chǎn)質量均一的MSCs。此外，在干細胞不同的臨床應用中，需要不同性質的生物材料的配合使用，通過優(yōu)化生物材料的性能，定向誘導分化達到更好的應用效果。相信隨著研究的不斷深入，MSCs多細胞球體的應用前景也將越來越廣闊，為不同組織創(chuàng)傷修復提供更有效的解決方案。