連續(xù)溫度變化對(duì)β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母β-葡聚糖的影響

段峰，盧雪梅，段永成，高培基

山東大學(xué) 微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100

溫度是生命環(huán)境的重要因素之一，是生命科學(xué)研究工作中必須控制的首要條件。研究溫度對(duì)生命體生長(zhǎng)繁殖的影響，以及溫度對(duì)生物酶反應(yīng)的效率等是生命科學(xué)研究領(lǐng)域中的一個(gè)關(guān)鍵內(nèi)容。目前實(shí)驗(yàn)室所用恒溫裝置主要是空氣浴、水浴形式，對(duì)溫度的控制為一室一控。在一個(gè)恒溫裝置中進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)只能獲得一個(gè)溫度點(diǎn)的特性數(shù)據(jù)，欲完成一條溫度特性曲線的完善描述，還需要多次實(shí)驗(yàn)才能完成，由于多次實(shí)驗(yàn)要受到環(huán)境條件、儀器穩(wěn)定性、試劑配制、操作手法等不確定性因素干擾，所得各溫度點(diǎn)的數(shù)據(jù)不適合溫度特性研究工作。綜觀已報(bào)道的溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程分析的報(bào)告，都是依據(jù)上述溫度梯度試驗(yàn)結(jié)果而作出的，通常都是相隔5 ℃和溫差±1 ℃下得到的，由此可見一個(gè)確切的溫度影響的動(dòng)力學(xué)過程是難以得到的，特別是對(duì)于“轉(zhuǎn)折點(diǎn)”的判斷會(huì)造成顯著誤差，而這又是微生物生理學(xué)和生物工程學(xué)上的重要參數(shù)。早在1958年，Halldal和French開始利用金屬鋁板產(chǎn)生溫度梯度，在其上鋪瓊脂介質(zhì)支持海藻生長(zhǎng)，并利用水槽、毛玻璃、紙梳形成光照梯度，進(jìn)行溫度與光照兩個(gè)因素對(duì)海藻生長(zhǎng)影響的研究[1]。后來有許多研究者改進(jìn)或自行設(shè)計(jì)新型溫度梯度裝置進(jìn)行溫度特性的相關(guān)研究工作。Thompson利用自制“溫度梯度柵”研究了溫度對(duì)野生植物種子的發(fā)芽影響與其對(duì)自身生長(zhǎng)環(huán)境適應(yīng)性的關(guān)系[2]；Blankley等利用燈泡為熱源，冷端暴露等設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)易的溫度梯度產(chǎn)生裝置，研究了溫度對(duì)卡氏球鈣板藻Cricosphaera carterae 生長(zhǎng)的影響[3]；Youdeowei采用金屬銅片作為溫度梯度產(chǎn)生介質(zhì)，研究了紅蝽Dysdercus intermedius的溫度適應(yīng)行為[4]；Clark等設(shè)計(jì)了一種不連續(xù)溫度梯度小室裝置，研究了細(xì)胞生長(zhǎng)與病毒復(fù)制的溫度特性[5]；Battley在前人設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，改進(jìn)并研究了連續(xù)溫度梯度下微生物生長(zhǎng)的最大、最適、最低生長(zhǎng)溫度，解決了非連續(xù)梯度實(shí)驗(yàn)中個(gè)別的適應(yīng)性生長(zhǎng)現(xiàn)象給判定生長(zhǎng)溫度極限帶來的誤差[6]；Siver改進(jìn)了培養(yǎng)海藻的裝置，使其可產(chǎn)生較大范圍的溫度梯度[7]。近些年，出現(xiàn)了一些較為特別的改進(jìn)。Wolf等設(shè)計(jì)了微型化、穩(wěn)定線性化的溫度梯度裝置[8]；Mao等設(shè)計(jì)了一種可控微流多通道的線性溫度梯度裝置，可廣泛用于研究催化反應(yīng)活化能、熔點(diǎn)、熒光量子產(chǎn)生曲線等[9]；Grodzicki等在傳統(tǒng)溫度梯度裝置上加裝紅外線探測(cè)器，并接入計(jì)算機(jī)實(shí)時(shí)記錄，研究了蜜蜂和蟑螂適應(yīng)溫度個(gè)體和群體表現(xiàn)行為的差異[10]。另外還有許多采用相似溫度梯度裝置進(jìn)行研究的報(bào)道[11-15]。

作者依據(jù)金屬板能產(chǎn)生連續(xù)溫度梯度的特性與生物溫度特性研究工作的需要，設(shè)計(jì)了具有連續(xù)溫度梯度板面和等間隔溫度梯度孔等的實(shí)驗(yàn)裝置，可在溫度梯度孔中放置 2×20個(gè)實(shí)驗(yàn)管，可一次獲取20個(gè)梯度溫度點(diǎn)的特性數(shù)據(jù)，足以精確描繪溫度特性曲線，可廣泛應(yīng)用于微生物液固培養(yǎng)、生物酶反應(yīng)、植物種子發(fā)芽、昆蟲繁育等相關(guān)生物技術(shù)領(lǐng)域的溫度特性研究。

β-1,3-葡寡糖是重要的功能性糖，可作為植物抗真菌病害免疫促進(jìn)劑，也有抗糖尿病活性[16]，還可誘導(dǎo)人血細(xì)胞產(chǎn)生抗腫瘤因子[17]等。本室研究獲得一株殼聚糖酶產(chǎn)生菌Mitsuaria chitosanitabida H12 (CGMCC 2949)，研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生一種內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶，可用來制備β-1,3-葡寡糖，并發(fā)現(xiàn)溫度是影響水解產(chǎn)物組分的重要因素，對(duì)其不同溫度下的酶解進(jìn)一步研究有望獲得大分子產(chǎn)物，擴(kuò)大該酶的應(yīng)用領(lǐng)域。本文利用生化溫度特性實(shí)驗(yàn)儀詳細(xì)研究了溫度對(duì)該酶酶解酵母 β-葡聚糖過程的影響，求出了反應(yīng)活化能、溫度衰減方程、產(chǎn)物組分變化等。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與β-1,3-葡聚糖酶

Mitsuaria chitosanitabida H12，由山東大學(xué)微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；經(jīng)由液體發(fā)酵、離心獲得上清、硫酸銨鹽析獲得粗酶，該粗酶經(jīng)分離純化為單一內(nèi)切型β-1,3-葡聚糖酶，其最適反應(yīng)溫度和pH分別為52 ℃和5.2。

1.2 主要儀器與試劑

溫度梯度產(chǎn)生裝置為自制生化溫度特性實(shí)驗(yàn)儀(專利號(hào)：201020015088.1)，示意圖見圖1。該儀器通過在金屬鋁板兩端分別加熱和制冷形成線性溫度梯度，并具有 20個(gè)等溫差梯度孔和連續(xù)的溫度梯度板面，溫度波動(dòng)范圍小于±0.1 ℃，設(shè)計(jì)高端極限95 ℃，低端極限?2 ℃，最大溫差60 ℃。利用等溫差梯度孔進(jìn)行固體試驗(yàn)時(shí)采用普通試管；液體試驗(yàn)時(shí)采用“L”型試管，封閉端插入試驗(yàn)孔中，開口端向上，溫度梯度板以圖1“C”為中軸作弧形往復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)，則試驗(yàn)液體在管中作往復(fù)流動(dòng)。利用連續(xù)溫度梯度板面進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)可采用普通平皿。

β-葡聚糖購于安琪酵母有限公司，β-葡聚糖含量70%；昆布二糖、昆布五糖購于 Seikagaku Kogyo (Japan)；昆布三糖、昆布四糖購于 Sigma-Aldrich (USA)；其他試劑為分析純，水為去離子水。

1.3 β-葡聚糖的酶解方法

將 β-葡聚糖和0.2 mol/L乙酸緩沖液 (pH 5.2)以3.5 ∶ 100 (W/V) 的比例混勻后，121 ℃滅菌30 min，趁熱磁力攪拌并自然冷卻。每支“L”型試管分裝9.00 mL，插入試驗(yàn)孔 (圖1B所示) 中并轉(zhuǎn)動(dòng)梯度板進(jìn)行預(yù)熱15 min，分別加入1.00 mL酶液，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取樣，每次取樣200 μL，加入含800 μL無水乙醇的1.5 mL離心管中，混勻終止反應(yīng)，10 000 r/min離心5 min，取上清備用。

1.4 酶解產(chǎn)物的分析

1.4.1 酶解產(chǎn)物的還原糖分析

采用DNS法測(cè)定[18]：取400 μL適當(dāng)稀釋后的樣品加入DNS試劑400 μL，沸水浴10 min，立即冷卻，取200 μL加入96孔板，并于酶標(biāo)儀 (Victor3TMV，PE company，USA) 上550 nm讀數(shù)，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)還原糖當(dāng)量計(jì)算還原糖濃度。

圖1 生化溫度特性實(shí)驗(yàn)儀主要組成部件示意圖Fig. 1 Diagram of Biochem-temperature Characteristic Apparatus. One end of aluminum board contains cartridge heaters (E), and the other end is connected to the circulating cooling device. Temperature is monitored by adjacent thermistor. The pump (D), tank, refrigerator, temperature controller, motor, and all the other components of the apparatus are placed in chassis except the aluminum board which was supported by bracket.

1.4.2 酶解產(chǎn)物的組分分析

酶解產(chǎn)物寡糖組成由薄層色譜 (TLC) 進(jìn)行分析，薄層板采用TLC-60 plate (Merck TLC Silica gel 60 F254)，點(diǎn)樣采用半自動(dòng)電動(dòng)點(diǎn)樣儀 (上?？普苌萍加邢薰?，展層劑為乙酸乙酯∶乙酸∶水= 2∶2∶1 (V∶V∶V) ，顯色條件為10% (V/V) 硫酸-乙醇溶液噴霧后130 ℃加熱10 min[19]。

1.4.3 酶解產(chǎn)物的純化

酶解液經(jīng)離心獲得上清，減壓蒸發(fā)至折光10%~15%，加入1%活性炭于70 ℃保溫30 min脫色，脫色液進(jìn)行活性炭柱層析分離[20]，洗脫液為水∶乙醇 (V/V)=1∶3，洗脫液經(jīng)減壓蒸發(fā)除掉乙醇，冷凍干燥后為純化的酶解產(chǎn)物樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì) β-1,3-葡聚糖酶酶解酵母 β-葡聚糖的影響

對(duì)于生物酶酶解反應(yīng)來說，一般是溫度升高則反應(yīng)速度提高，在長(zhǎng)時(shí)間酶解反應(yīng)過程中，過高的溫度可提高初始速度但加速酶的失活，不利于產(chǎn)物的積累，而較低的溫度有利于酶的穩(wěn)定。利用生化溫度特性實(shí)驗(yàn)儀，在22 ℃~60 ℃范圍內(nèi)以2 ℃為間距的20個(gè)等溫差實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行了酶解實(shí)驗(yàn)，研究了溫度對(duì)該酶酶解酵母 β-葡聚糖反應(yīng)過程的影響。圖2為采用Interpolant函數(shù) (MATLAB R2009b sftool)以溫度和時(shí)間對(duì)產(chǎn)物濃度作圖。從圖 2上的不對(duì)稱可以得出，隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)物積累最大的溫度并不是一成不變的，而是略微下降的。即酶解反應(yīng)開始1 h內(nèi)，最大產(chǎn)物積累接近50 ℃，而9 h則下降到40 ℃附近。

通過對(duì)每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行Gaussian函數(shù)平滑(MATLAB R2009b cftool)，并獲得最大值對(duì)應(yīng)的溫度，以時(shí)間對(duì)其作圖 (圖 3)，在采樣時(shí)間區(qū)域內(nèi)的最適溫度隨時(shí)間的變化呈指數(shù)衰減。其中由擬合方程參數(shù)c給出的極限最適溫度39.54 ℃與該酶的熱穩(wěn)定性相吻合 (40 ℃以下保溫24 h，殘存活力大于90%，數(shù)據(jù)未列出)；由方程指出的0時(shí)刻的最適溫度49.32 ℃與該酶的最適反應(yīng)溫度52 ℃相接近，說明該指數(shù)方程能很好的解釋最適酶解溫度隨時(shí)間的變化過程。

圖2 溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物生成的影響Fig. 2 Effects of temperature and reaction time on the hydrolytic products. Yeast β-glucan was hydrolyzed by β-1,3-glucanase (1 U/mL) under different temperature (22 °C?60 °C, 2 °C intervals) on the Biochem-temperature Characteristics Apparatus.

圖3 最適酶解溫度與時(shí)間的關(guān)系Fig. 3 Relationship between the optimum temperature and the reaction time. The optimum temperature at each time point was solved by Gaussian curve fitting in MATLAB R2009b to the data from Fig.2.

該酶對(duì)酵母 β-葡聚糖的水解歷程符合雙曲線方程，如圖4的46 ℃、48 ℃所示；而58 ℃、60 ℃等高溫區(qū)，因酶快速失活，用雙曲線擬合極限比較準(zhǔn)確，但相應(yīng)初速度的擬合值偏差會(huì)較大；24 ℃、26 ℃等低溫區(qū)，酶解歷程基本呈直線變化，同用雙曲線擬合，與高溫區(qū)相反，初速度較為準(zhǔn)確，極限值并不合理。說明酶解過程在高溫區(qū)產(chǎn)物積累速度迅速減低，主要是伴隨著酶的熱失活；而低溫區(qū)，酶解速度微量下降主要是由于底物濃度的下降引起的。

圖4 酵母β-葡聚糖的酶解反應(yīng)歷程Fig. 4 Hydrolytic process of yeast β-glucan by β-1,3-glucanase at different temperature. The data for hyperbolic curve-fitting came from Fig. 2.

根據(jù)酶解反應(yīng)歷程曲線，求得每個(gè)溫度下的酶解反應(yīng)初速度 (原點(diǎn)處的一階導(dǎo)數(shù)) 代替反應(yīng)速率常數(shù)，并以?1/RT對(duì)其做圖 (圖5)，可以得到酶解最大初始反應(yīng)速度在 48 ℃~50 ℃(?1/RT=[?3.745，?3.722]×10?4)之間，從全部數(shù)據(jù)范圍看，該反應(yīng)類型不符合阿累尼烏斯經(jīng)驗(yàn)公式，然而48 ℃之前的反應(yīng)可以用阿累尼烏斯經(jīng)驗(yàn)公式來解釋，其活化能Ea為84.17 kJ/mol。

2.2 溫度對(duì)酶解產(chǎn)物組分的影響

2.2.1 對(duì)酶解產(chǎn)物組分的TLC分析

圖5 酶解反應(yīng)初始速度與溫度的關(guān)系Fig. 5 Initial reaction rate changed with temperature. The xlabel, ‘R’ is molar gas constant and ‘T’ is absolute temperature.‘V0’ is initial velocity, ‘A’ is pre-exponential factor, ‘Ea’ is activation energy. The initial velocity at 22 °C?48 °C was solved by hyperbolic fitting and seeking the first-order derivative at its origin (0) point.

圖6 不同溫度酶解產(chǎn)物組分的TLC分析Fig. 6 Thin-layer chromatography of hydrolytic products of yeast β-glucan by β-1,3-glucanase at different temperature. G is glucose; L2?L5 are laminaribiose, laminaritriose, laminaritetraose and laminaripentaose, respectively. ‘S’ is 1,3-β-D-glucooligosaccharide markers comprising G and L2?L5.

溫度對(duì)該酶酶解酵母 β-葡聚糖的影響，不僅表現(xiàn)在酶解產(chǎn)物生成速度上 (圖 4)，而且表現(xiàn)在水解產(chǎn)物組分上。上文2.1節(jié)的8 h產(chǎn)物經(jīng)薄層色譜分析(圖6)，結(jié)果顯示，酶解產(chǎn)物組分隨溫度變化可以劃分為4個(gè)部分：1) 50 ℃以上，產(chǎn)物主要以昆布二糖和昆布三糖為主；2) 46 ℃~42 ℃，大于昆布三糖的寡糖比例已經(jīng)有明顯增加；3) 38 ℃~30 ℃，以昆布二糖-五糖為主；4) 30 ℃以下，產(chǎn)物以昆布五糖及更大分子量的寡糖為主。

2.2.2 酶解產(chǎn)物組分的13C NMR鑒定

酶解產(chǎn)物樣品，同標(biāo)準(zhǔn)品昆布二糖和昆布三糖用D2O配制成20 mg/mL進(jìn)行13C NMR (AVANCE 400) 測(cè)定，結(jié)果見圖7。根據(jù)SDBS數(shù)據(jù)庫 (Spectral Database for Organic Compounds，Japan) 中的昆布二糖 (SDBS No.11561)13C NMR圖譜說明，其β-1,3-D-glycosidic的C3特征化學(xué)位移在83和85附近，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照完全一致，為 1,3-β-D-葡寡糖。

3 討論

3.1 生化溫度特性實(shí)驗(yàn)儀

諸如前言中所述，溫度梯度裝置的發(fā)展中有許多研究工作者對(duì)其做了相應(yīng)改進(jìn)，以求達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?。這些改進(jìn)主要分為 2個(gè)方面：一是溫度梯度裝置本身，例如，在梯度板上做圓孔配合試管達(dá)到不連續(xù)溫度梯度液體培養(yǎng)的需求[21-23]；在梯度板上做與梯度平行的凹槽配合試管達(dá)到連續(xù)溫度梯度固態(tài)培養(yǎng)需求[6]；在梯度板上用絕熱材料將板面分成若干小室，配合細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞和病毒[5]。雖然梯度板的溫度梯度是線性的[3]，其內(nèi)部孔也是線性的[21]，但是裝置兩端的溫度不是完全線性[5]，這是由于分開的小室在溫度梯度板外，小室內(nèi)的溫度受環(huán)境影響較大。二是附屬裝置，例如，增加光照部分配合海藻等生長(zhǎng)的需求[1,3,7]；增加紅外探測(cè)部分配合昆蟲的檢測(cè)[10]。但它們都是為滿足單一實(shí)驗(yàn)需求而改進(jìn)的裝置，不適合多用途使用，而附屬裝置是獨(dú)立于溫度梯度裝置外的部分，與儀器本身性能影響無關(guān)。

圖7 純化的酶解產(chǎn)物的13C核磁共振波譜Fig. 7 13C NMR of 1,3-β-D-glucooligosaccharide and the purified products.

圖8 溫度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig. 8 Effects of temperature on the growth of E. coli. (A) Surface fitting of sample data using interpolant function of MATLAB R2009b. (B) Fitting of logistic equation to the data.

作者綜合前人的經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)一步完善和創(chuàng)新，設(shè)計(jì)并研制成功了一種用途更廣泛的新型溫度梯度產(chǎn)生裝置，命名為生化溫度特性實(shí)驗(yàn)儀。該儀器采用分體模塊設(shè)計(jì)，使一套溫度梯度系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)多功能。如圖1所示為進(jìn)行液、固培養(yǎng)的梯度板，可以用來研究微生物生長(zhǎng)曲線 (圖 8)、酶反應(yīng)歷程(圖 2)、食用菌菌絲生發(fā)與出菇、植物根的生發(fā)等；使用工字型梯度板作為母板，分別使用不同配件可以實(shí)現(xiàn)固體培養(yǎng)管研究生長(zhǎng)溫度極限[6,23]， Halldal等的平板培養(yǎng)[1]，Pires等的昆蟲研究[12]，還可以實(shí)現(xiàn)酶反應(yīng)的溫度、pH與時(shí)間多因素影響等研究。除了上文中所述酶解酵母 β-葡聚糖條件的研究工作，作者還利用該儀器進(jìn)行了大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌、食用真菌等微生物生長(zhǎng)的研究，圖8所示為大腸桿菌在該儀器上的生長(zhǎng)情況，A為interpolant函數(shù) (MATLAB R2009b sftool) 以溫度和時(shí)間對(duì)OD600作圖，B為部分?jǐn)?shù)據(jù)的Logistic方程擬合，其R2＞0.98，可以看出溫度特性曲線平滑，具有很強(qiáng)的相關(guān)性，比傳統(tǒng)手段具有較強(qiáng)優(yōu)勢(shì)，這主要是該儀器克服了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中分次進(jìn)行所造成的菌種不一致性等影響，因?yàn)榧词挂設(shè)D600控制每次實(shí)驗(yàn)的接種量也不能保證菌種的生理狀態(tài)完全一致[24]；同時(shí)，該儀器的弧形往復(fù)振蕩方式優(yōu)于旋轉(zhuǎn)與直線往復(fù)搖瓶機(jī)的性能，利于液體均勻混合與增加溶氧。

與溫度有關(guān)的多因素實(shí)驗(yàn)中，該儀器在微生物生長(zhǎng)溫度特性曲線研究中的優(yōu)勢(shì)上文已論述，而如酶反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)材料的穩(wěn)定性影響可以忽略，因此傳統(tǒng)的分批次實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果影響不大，但存在時(shí)間浪費(fèi)較多的情況。例如作者在研究該酶的最適反應(yīng)條件時(shí)，設(shè)計(jì)了3個(gè)因素 (溫度、pH與時(shí)間) 和4水平，其中反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)為1 h，則需7 h完成實(shí)驗(yàn)，而用該儀器只需2 h即可完成；而且該儀器的溫度波動(dòng)范圍為±0.1 ℃，達(dá)到超級(jí)恒溫水浴的精度指標(biāo)，且波動(dòng)為同一時(shí)間同一方向，操作方便，便于精細(xì)研究。

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