熱休克蛋白HSP60基因在耐藥白血病中的表達(dá)研究

雷博

多藥耐藥（MDR）[1]是白血病化療失敗的主要原因，目前已知的多藥耐藥機(jī)制還不能完全解釋白血病的MDR現(xiàn)象，因此發(fā)現(xiàn)新的耐藥相關(guān)且共表達(dá)的基因是揭示白血病MDR機(jī)理、改善化療效果和預(yù)后的迫切需要。我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用改良的消減雜交技術(shù)以急性白血病耐藥細(xì)胞系（HL60/VCR）和敏感細(xì)胞系（HL60）為研究對(duì)象建立了急性白血病多藥耐藥相關(guān)消減cDNA文庫(kù)[2]，篩選出23條表達(dá)有差異的基因，經(jīng)查閱文獻(xiàn)和生物信息學(xué)分析，本實(shí)驗(yàn)從中選取熱休克蛋白HSP60基因作為進(jìn)一步的研究對(duì)象，應(yīng)用熒光定量RT-PCR的方法在臨床病例中進(jìn)行檢測(cè)，以分離和確認(rèn)新的白血病耐藥相關(guān)基因。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

白血病患者39例，選自2008年11月～2009年11月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科住院病人，均在本院血液實(shí)驗(yàn)室經(jīng)FAB形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)的MIC分型確診，符合造血組織腫瘤新WHO分類標(biāo)準(zhǔn)。其中非淋巴細(xì)胞白血病23例（化療敏感者17例，耐藥者6例），淋巴細(xì)胞白血病13例（化療敏感者7例；耐藥者6例），急性混合細(xì)胞白血病1例（為耐藥者），多發(fā)性骨髓瘤2例（化療敏感者1例，耐藥者1例）。男性20例，女性19例，中位年齡35歲（5～75歲）。同時(shí)以6名健康人為對(duì)照組，男4例，女2例，中位年齡28歲。（臨床耐藥診斷標(biāo)準(zhǔn)參閱1997年全國(guó)難治性白血病研討會(huì)所制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。）

1.2 骨髓和外周血細(xì)胞HSP60mRNA表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)抽取樣本骨髓（臨床患者）或外周血（正常健康人），用淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破饭井a(chǎn)品）分離單個(gè)核細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，用紫外吸收測(cè)定法檢測(cè) RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察并拍照。5μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（MBI公司產(chǎn)品），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為70℃5分鐘,42℃1小時(shí)、70℃10分鐘，cDNA溶液儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆?。HSP60及內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增引物見(jiàn)表1，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

按照SYBR Premix real time PCR Mix（AmpliQ公司）試劑說(shuō)明檢測(cè)HSP60和內(nèi)參β-actin的mRNA表達(dá)水平，使用 AB I GeneAmp5700 real time PCR儀完成real time PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，然后按94℃30秒，62℃1分鐘，72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。對(duì)每一樣本同時(shí)進(jìn)行3個(gè)PCR反應(yīng)檢測(cè)，PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldViewTM染色，以檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

表1 引物列表

表2 白血病組與正常對(duì)照組HSP60基因表達(dá)的比較

表3 耐藥與敏感組HSP60基因表達(dá)的比較

表4 HSP60基因在AML與ALL中表達(dá)的比較

本研究用比較Ct值相對(duì)定量法檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，應(yīng)用公式為：①根據(jù)靶基因和內(nèi)參照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線用公式Y(jié)=101 /△Ct（△Ct等于靶基因每稀釋10倍時(shí)，平均增加的Ct數(shù)）分別計(jì)算兩者Ct值每減少1個(gè)循環(huán)時(shí)對(duì)應(yīng)的模板DNA的增加倍數(shù)，求出Y值；②靶基因的相對(duì)含量，公式為：Y靶Ct靶基因均值-Ct靶基因（Ct靶基因平均值表示所有樣本中靶基因的Ct值的均數(shù)，Ct靶基因表示不同個(gè)體樣本的靶基因Ct值）；③用同一個(gè)體的內(nèi)參β-actin對(duì)其HSP60的mRNA表達(dá)水平做標(biāo)準(zhǔn)化處理，代表這1個(gè)個(gè)體白血病細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平，公式為：Y靶標(biāo)準(zhǔn)化=Y靶/Yβ-actin。比較標(biāo)準(zhǔn)化后各組HSP60mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

熒光定量PCR結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，原始數(shù)據(jù)用Excel錄入，用Kruskal-wallis H檢驗(yàn)，組間比較用Mannwhitney U檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果對(duì)所提取總RNA經(jīng)分光光度計(jì)檢測(cè)，其A260/A280比值均在1.8..2.1之間，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，溴化乙錠染色，28S、18S、5S帶清晰可見(jiàn)，無(wú)明顯降解。根據(jù)靶基因和內(nèi)參照基因β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線用公式Y(jié)=101/△Ct，計(jì)算β-actin和HSP60的Y值近似相同約為2.15。表示各基因Ct值減少1個(gè)循環(huán)對(duì)應(yīng)的模板DNA的增加倍數(shù)為2.15倍。既然Y值近似相等，那么可以應(yīng)用簡(jiǎn)化公式2.15Ct內(nèi)參照基因-Ct靶基因來(lái)計(jì)算每一樣品每一基因的相對(duì)含量，最終得到的值即為此樣品此基因的校正后的相對(duì)含量。

從表2可以看出HSP60基因在AL和正常組中的表達(dá)量有顯著性差異，白血病組mRNA的表達(dá)明顯高于正常組；從表3可以看出HSP60基因在耐藥和敏感組中的表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，耐藥組明顯高于敏感組；從表4可以看出HSP60基因在ALL和AML患者中的表達(dá)，沒(méi)有明顯差異。

3 討論

在白血病的治療中MDR已成為阻礙其療效的一個(gè)重要問(wèn)題，對(duì)各種耐藥機(jī)制作用的深入研究必將有利于提高化療療效。既往研究已發(fā)現(xiàn)了很多耐藥機(jī)制，但以這些分子作為靶點(diǎn)的耐藥逆轉(zhuǎn)研究目前仍存在許多難以克服的問(wèn)題，繼續(xù)尋找新的耐藥分子靶點(diǎn)仍是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。

熱休克蛋白HSP是普遍存在于生物體細(xì)胞中的一組高度保守的蛋白質(zhì)，平時(shí)表達(dá)量很低，在理化因素、病原體及細(xì)胞惡變等應(yīng)激狀態(tài)下合成量增加。熱休克蛋白的生物學(xué)功能廣泛，主要通過(guò)在應(yīng)激狀態(tài)下保護(hù)細(xì)胞生命活動(dòng)必需的蛋白質(zhì)以維持細(xì)胞生存，增加細(xì)胞耐受性和抗凋亡能力。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，熱休克蛋白的大量表達(dá)可能由于腫瘤細(xì)胞的不斷增殖需要HSP作為分子伴侶來(lái)調(diào)節(jié)和穩(wěn)定這一增殖過(guò)程[3]。一方面HSP可與多種原癌基因相互作用，影響細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖；另一方面介導(dǎo)錯(cuò)配蛋白的降解，協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)快速代謝平衡，使腫瘤細(xì)胞得以無(wú)限增殖。此外，HSP在腫瘤細(xì)胞的抗凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4]。正常細(xì)胞中僅表達(dá)少量HSP參與細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，并受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控，而腫瘤細(xì)胞即使在無(wú)應(yīng)激條件下，也能獨(dú)立于細(xì)胞周期持續(xù)高表達(dá)HSP，在維持細(xì)胞的永生性上起作用。HSP作為分子伴侶在正常細(xì)胞中發(fā)揮抵抗應(yīng)激的保護(hù)作用，在腫瘤細(xì)胞中則表現(xiàn)為對(duì)化療的耐受性增強(qiáng)，可能與白血病細(xì)胞的多藥耐藥有關(guān)。HSP70、HSP27[5]已有研究證明與AL耐藥相關(guān)，而HSP60[6]作為熱休克蛋白的主要成員其與腫瘤耐藥的研究報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明：HSP60基因在AL耐藥組、敏感組和正常對(duì)照組間有顯著性差異；白血病組高于正常對(duì)照組，與研究報(bào)道一致；耐藥組高于敏感組，P＜0.05。ALL患者HSP60mRNA的表達(dá)水平高于AML患者，但結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

總之，本實(shí)驗(yàn)從cDNA文庫(kù)中選取熱休克蛋白HSP60，研究其在臨床病例中的表達(dá)情況，在臨床上對(duì)AL患者提供化療效果、評(píng)判預(yù)后和指導(dǎo)個(gè)體化治療的實(shí)驗(yàn)室和理論依據(jù)，同時(shí)篩選出新的MDR相關(guān)基因，為發(fā)現(xiàn)白血病MDR發(fā)生的新機(jī)制和逆轉(zhuǎn)耐藥治療提供新的途徑和靶點(diǎn)。

[1]Norgaard JM,Olesen LH,Hokland P.Changing picture of cellular drug resistance in human leukemia[J].Crit Rev Oncol Hematol,2004,50（1）：39-49.

[2]吉蕾,張王剛,藥立波,等.急性白血病多藥耐藥相關(guān)消減cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與鑒定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué),2004；12（4）：431-435.

[3]Cha Cardoso F,Di Leo A,Larsimont D,et al.Evaluation of HER2，p53,bcl-2,topoiso- merase II-alpha,heat shock proteins 27and 70 in primary breast cancer and metastatic ipsilateral axillary lymph nodes[J].Ann Oncol，2001,12（5）：615-620.

[4]Xavier Thomas.Expression of heat-shock proteins is associ-ated with major adverse prognostic factors in acute myeloid leukemia[J].Leukemia Res,2005（29）：1049-1058.

[5]uhan D,Saxena S,Anderson K C,et al.Hsp27 inhibits release of mitochondrial protein Smac in multiple myeloma cells and confers dexamethasone resistance[J].Blood,2003,102（9）：3379-3386.

[6]Cappello F,David S,Rappa F,et al.The expression of HSP60 and HSP10 in large bowel carcinomas with lymph node metastase[J].BMC Cancer，2005,5-39.