菊粉酶基因在釀酒酵母中的表達及乙醇發(fā)酵

李楠楠，袁文杰，王娜，辛程勛，葛旭萌，白鳳武

1 大連理工大學 生命科學與技術(shù)學院，大連 116024

2 大慶九環(huán)生物能源有限公司，大慶 163511

目前國內(nèi)外燃料乙醇主要使用糖質(zhì)和淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)，隨著陳化糧的消耗殆盡，燃料乙醇需求的增長，尋找非糧原料生產(chǎn)燃料乙醇已成為我國燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基本方向。

菊芋Jerusalem artichoke耐瘠薄、耐鹽堿、抗干旱、生物質(zhì)產(chǎn)量高，其主要成分是菊粉，占塊莖干重的60%~70%，由果糖殘基經(jīng)β-2,1糖苷鍵脫水聚合而成，末端為一個葡萄糖分子[1]，可以通過酸解和酶解等途徑轉(zhuǎn)化為易于發(fā)酵的果糖[2]。與目前國內(nèi)外普遍關(guān)注的秸稈類生物質(zhì)相比，不需要復雜的預處理，且水解產(chǎn)物也不含難以利用的五碳糖[3-4]，是我國燃料乙醇及其他生物基化學品生產(chǎn)的良好糧食替代原料。

國內(nèi)外對利用菊芋塊莖生產(chǎn)乙醇進行了大量的文獻報道[5-11]，其中效果最好的當屬克魯維酵母的一步法發(fā)酵工藝，菊芋的糖化和發(fā)酵均由克魯維酵母自身完成，原料不需預先糖化，節(jié)約了能耗和額外添加酶的費用[12]，但其缺點是克魯維酵母屬于非常規(guī)酵母，其乙醇產(chǎn)生機制尚不明了，乙醇耐性較釀酒酵母差，發(fā)酵過程乙醇收率僅為 80%左右，終點乙醇濃度 6%~7%，遠遠低于淀粉質(zhì)原料乙醇發(fā)酵收率達到理論值 90%以上和發(fā)酵終點乙醇濃度10%~12%的技術(shù)指標，并且發(fā)酵速率慢，時間很長，導致發(fā)酵罐設備生產(chǎn)強度很低。因此，通過誘變育種或采用基因工程的方法選育能夠高效發(fā)酵菊芋生產(chǎn)乙醇的菌種是菊芋原料生產(chǎn)燃料乙醇的發(fā)展方向，其中最有效的方法就是以乙醇耐性較高的釀酒酵母為受體菌，構(gòu)建能夠高效分泌菊粉酶的基因工程菌株。

在酵母基因組中，ho單拷貝基因編碼核酸內(nèi)切酶，負責完成酵母a型和α型之間的轉(zhuǎn)換，普遍存在于出芽繁殖的酵母中[13]，并且該基因是生長非必需的，破壞 ho基因不會影響酵母生長[14]。Warren等[15]構(gòu)建了以ho起始密碼?2720~?1814為左邊界，+1 199~+1 699為右邊界的整合載體，實現(xiàn)了外源基因在釀酒酵母中的表達。

本研究以工業(yè)釀酒酵母作為受體菌株，以ho位點為整合位點，使菊粉酶基因在釀酒酵母中得到表達，進而使釀酒酵母在自身優(yōu)良的發(fā)酵性能基礎(chǔ)上利用菊芋粉一步發(fā)酵得到乙醇，為菊粉發(fā)酵燃料乙醇的工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本實驗過程中涉及的菌株及質(zhì)粒列于表1中。

其中釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 6525為本實驗用的出發(fā)菌株，具有良好的乙醇發(fā)酵性能；釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae 288c、馬克斯克魯維酵母Kluyveromyces marxianus及大腸桿菌E. coli DH5α為本實驗室保存菌種；HI6/6為本實驗構(gòu)建的含有帶自身啟動子的菊粉酶基因的基因工程菌；HPI6/3為本實驗構(gòu)建的帶pgk啟動子的菊粉酶基因的基因工程菌；HO-2 (6 062 bp) 質(zhì)粒為本實驗室保存；質(zhì)粒HO/inu (7 729 bp) 是不帶啟動子的菊粉酶整合表達載體，為本實驗室構(gòu)建并保存；HO/p-inu (8 349 bp) 是帶自身啟動子的菊粉酶基因的整合表達載體，為本研究構(gòu)建；HO/pgk-inu (8 547 bp) 是帶pgk啟動子的菊粉酶基因的整合表達載體，為本研究構(gòu)建。

1.1.2 工具酶和化學試劑

引物合成和序列測定委托TaKaRa (大連) 公司完成。Taq DNA聚合酶、限制內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA marker等購自TaKaRa (大連) 公司；菊粉購自內(nèi)蒙古億利生物技術(shù)有限公司；菊芋購自山東濟寧，用前進行烘干粉碎并過60目篩，經(jīng)測定，100 g菊芋粗粉中含有 63 g的菊糖。G418購自Sigma公司；DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒與凝膠回收試劑盒均購自Solarbio公司。

表1 實驗菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基 (g/L)：無水葡萄糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，121 ℃滅菌15 min，用于酵母菌的培養(yǎng)。

YPD選擇培養(yǎng)基 (g/L)：無水葡萄糖 20，酵母浸粉10，蛋白胨20，121 ℃滅菌15 min，冷卻后加入G418，使其終濃度為300 mg/L，用于酵母菌轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)。

LB培養(yǎng)基 (g/L)：氯化鈉 10，酵母浸粉5，蛋白胨10，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min，用于E. coli菌株的培養(yǎng)。

LB選擇培養(yǎng)基 (g/L)：氯化鈉10，酵母浸粉5，蛋白胨10，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min，冷卻后加入Amp，使其終濃度為100 mg/L，用于E. coli轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)。

菊粉培養(yǎng)基 (g/L)：菊粉40，酵母粉4，蛋白胨4，121 ℃滅菌15 min，用于酵母菌轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶培養(yǎng)。

菊芋粗粉培養(yǎng)基：60目以下的菊芋粗粉加自來水配成的培養(yǎng)基，料水比為1∶4，菊糖濃度為126 g/L，無其他成分添加，未滅菌，用于酵母菌轉(zhuǎn)化子的乙醇發(fā)酵。

1.2 方法

1.2.1 菊粉酶基因整合表達載體的構(gòu)建

根據(jù)菊粉酶 (GenBank Accession No. X57202)序列，設計引物p-inu forward primer和p-inu reverse primer，以 K. marxianus基因組為模板擴增 p-inu基因 (引物序列見表2)。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，63.6 ℃ 1 min ，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。根據(jù)pgk啟動子序列(GenBank Accession No. BK006937.1)，設計引物pgk forward primer和pgk reverse primer，以釀酒酵母S. cerevisiae 288c基因組為模板擴增pgk啟動子基因。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min ，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，分別與載體pMD19-T連接。陽性克隆提取質(zhì)粒后測序，分別命名為pMD19T/p-inu和pMD19T/pgk。pMD19T/p-inu經(jīng) BamHⅠ、BssHⅡ雙酶切后與經(jīng)過同樣處理的HO-2進行連接；pMD19T/pgk經(jīng)BsiWⅠ、BamHⅠ雙酶切后與經(jīng)過同樣處理的HO/inu進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細胞，在LB選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落，小量提取質(zhì)粒酶切鑒定并進行 DNA序列測定，得到整合載體 HO/p-inu和HO/pgk-inu。引物設計利用Pimer Premier 5.0軟件，質(zhì)粒的提取、酶切、連接和E. coli轉(zhuǎn)化均按Sambrook等[16]的方法進行。

表2 本實驗所用的引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.2.2 S. cerevisiae 6525的轉(zhuǎn)化

整合載體HO/p-inu、HO/pgk-inu，經(jīng)NotⅠ酶切后，進行瓊脂糖電泳，回收目的DNA片段，采用電擊法轉(zhuǎn)化S. cerevisiae 6525感受態(tài)細胞，在含有300 mg/L G418的YPD平板上篩選轉(zhuǎn)化子。詳細操作參考BIORAD說明書。

1.2.3 轉(zhuǎn)化子的驗證

分別提取 HI6/6及 HPI6/3轉(zhuǎn)化子的基因組DNA。采用PCR法進行驗證。HI6/6的驗證所使用的引物序列為HI6/6 forward primer和HI6/6 reverse primer。HPI6/3的驗證所使用的引物序列為 HPI6/3 forward primer和HPI6/3 reverse primer。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶情況考察

取 S. cerevisiae 6525和整合子 HI6/6及HPI6/3各100 μL，接至50 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后，按10%接種到菊粉培養(yǎng)基，100 mL/250 mL搖瓶，每24 h取樣測定生物量、菊粉酶活性。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子發(fā)酵性能考察

取S. cerevisiae 6525和轉(zhuǎn)化子HI6/6及HPI6/3各100 μL，接至50 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h后，按10%接種到菊芋粗粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，100 mL/250 mL搖瓶，厭氧發(fā)酵，每12 h取樣測定菊粉酶的活性、還原糖、總糖及乙醇含量。乙醇對理論值的收率=乙醇/(總糖?剩余總糖)/0.511。

1.2.6 分析方法

還原糖及總糖測定方法：還原糖采用DNS法測定，總糖經(jīng)酸水解后用 DNS 法測定。

菊粉酶活的測定方法：取適量發(fā)酵上清液，用0.1 mol/LHAc-NaAc緩沖液 (pH 4.6) 稀釋，取50 μL稀釋液加入450 μL 5%菊粉溶液，混勻，60 ℃水浴反應10 min (精確計時)，立即取出沸水浴5 min滅活，從反應液中取出50 μL，加入1.5 mL DNS試劑+1.95 mL水，混勻，沸水浴中5 min，冷水冷卻，用容量瓶定容至25 mL，測OD540。對應果糖標準曲線計算得樣品反應液中的含糖量(mg)?？瞻讓φ眨喝“l(fā)酵上清稀釋液沸水5 min滅活，同上反應，作為對照。菊粉酶活性單位定義：每分鐘產(chǎn)生1 μmol果糖所需酶量。

乙醇測定方法：乙醇濃度利用SBA生物傳感分析儀 (山東省科學院生物研究所) 測定。

生物量測定采用干重法[17]：取一定體積的樣品置于預先烘干稱重的離心管中，離心后的沉淀用蒸餾水洗滌2次，然后置85 ℃的恒溫烘箱中烘至恒重后稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 菊粉酶基因整合表達載體的構(gòu)建

構(gòu)建菊粉酶基因整合表達載體的圖譜如圖 1所示。

圖1 菊粉酶基因整合載體的示意圖Fig. 1 Map of the inulinase integrating expression system.

首先以K. marxianus基因組DNA 為模板，采用PCR法擴增p-inu基因，擴增出特異性譜帶，大小約為2.4 kb，與預期一致；以S. cerevisiae288c基因組DNA為模板，采用PCR法擴增pgk基因，擴增出特異性譜帶，大小約為800 bp，結(jié)果如圖2所示，與預期一致。經(jīng)Blast比對，與模板的相似性達100%。HO/p-inu經(jīng)NotⅠ酶切出現(xiàn)3.1 kb和5.3 kb兩條譜帶，HO/pgk-inu經(jīng)NotⅠ酶切出現(xiàn)3.1 kb和5.4 kb兩條譜帶，結(jié)果如圖3所示，證明整合載體的連接成功。

圖2 PCR法擴增馬克斯克魯維酵母的菊粉酶基因和釀酒酵母288c的pgk啟動子基因Fig. 2 Amplification of the p-inu gene from K. marxianus and the pgk gene from S. cerevisiae 288c by PCR. M1: DL2000 DNA marker; 1?3: pgk promoter; 4: p-inu gene; M2: 1 kb marker.

圖3 重組質(zhì)粒的NotⅠ酶切鑒定Fig. 3 Recombinant plasmids digested with Not I. M: 1 kb marker; 1?5: HO/pgk-inu digested with Not I; 6: HO/p-inu digested with Not I.

2.2 S. cerevisiae 6525的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗證

NotⅠ酶切載體HO/p-inu、HO/pgk-inu，分別回收5.3 kb和5.4 kb的線性目的片段，電擊法轉(zhuǎn)化，涂布含有300 μg/mL G418的YPD培養(yǎng)基。挑取選擇平板上的抗性菌落進行培養(yǎng)。對生長出的菌體依次進行基因組的提取和PCR擴增，HO/p-inu轉(zhuǎn)化子擴增的片段包括HO的左邊界，菊粉酶基因和kam基因，預期的目標序列的長度為4.8 kb；HO/pgk-inu轉(zhuǎn)化子擴增的片段包括 pgk的后半部分和菊粉酶基因的前半部分，預期的目標序列的長度為1 kb，而出發(fā)菌株無整合片段，PCR結(jié)果應為陰性。PCR的電泳結(jié)果如圖4所示。HI6/6和HPI6/3的產(chǎn)物大小與預期相符，對PCR產(chǎn)物進行測序證明外源基因隨HO片段與染色體同源區(qū)域發(fā)生重組而整合到染色體上?；蚬こ叹跓o篩選壓力下連續(xù)培養(yǎng)20代以上，仍然保持G418抗性，說明整合的基因片段是穩(wěn)定的。

圖4 轉(zhuǎn)化子HI6/6和HPI6/3的PCR驗證Fig. 4 Confirmation of the recombinants HI6/6 and HPI6/3 by PCR. M: 1 kb marker; 1: plasmid HO/p-inu; 2, 6: S. cerevisiae 6525; 3: HI6/11; 4: HI6/6; 5: plasmid HO/pgk-inu; 7: HPI6/3; 8: HPI6/4.

2.3 轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)酶情況

為了考察轉(zhuǎn)化子由于 ho基因的破壞是否對酵母的生長產(chǎn)生不利的影響及轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶的情況，按照前述的實驗方法在搖瓶中對轉(zhuǎn)化子的生長和產(chǎn)酶能力進行測定，結(jié)果如圖5所示?？梢奌PI6/3的生物量在24 h達到了6.4 g/L，在168 h時達到9 g/L，幾乎與出發(fā)菌株生長一致，而 HI6/6的生物量雖然略低于出發(fā)菌株與HPI6/3，但終點的生物量仍然達到8.2 g/L，說明轉(zhuǎn)化子的生長狀況并沒有受到影響。至于產(chǎn)酶情況，轉(zhuǎn)化子 HI6/6的酶活明顯高于出發(fā)菌株，48 h前酶活沒有明顯提高，之后酶活迅速提高，在144 h達到最高酶活86 U/mL，是出發(fā)菌株的4.5倍，而HPI6/3的酶活略高于出發(fā)菌株，在120 h達到最高，為23.8 U/mL。由此可以看出，該菊粉酶基因利用自身的啟動子比pgk啟動子表達的菊粉酶活要高。

圖5 宿主菌和轉(zhuǎn)化子HI6/6及HPI6/3的生長情況及菊粉酶活力的變化Fig. 5 Yeast cell growth and inulinase production of the host and recombinants HI6/6 and HPI6/3 at aerobic conditions. Biomass and inulinase activity: S. cerevisiae 6525 (◆ and ◇ ); HI6/6 (▲ and △ ); HPI6/3 (■ and □).

2.4 轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵情況

圖6 轉(zhuǎn)化子HI6/6及HPI6/3的菊芋粉乙醇發(fā)酵性能Fig. 6 Ethanol fermentation performance of HI6/6 and HPI6/3 in the batch fermentations from Jerusalem artichoke. (A) Total sugar and ethanol concentration. S. cerevisiae 6525 (◆ and ◇ ) , HI6/6 (▲ and △ ) and HPI6/3 (■ and □). (B) Reducing sugar concentration and inulinase activity. S. cerevisiae 6525 (◆ and ◇ ); HI6/6 (▲ and △ ); HPI6/3 (■ and □).

在搖瓶中對轉(zhuǎn)化子HI6/6及HPI6/3的乙醇發(fā)酵性能進行了測定，結(jié)果如圖6所示。由圖可以看出，轉(zhuǎn)化子在前24 h，乙醇濃度迅速提高，總糖含量迅速下降，還原糖濃度降低到3 g/L，是發(fā)酵的主要階段；24 h后，乙醇濃度增加緩慢，到48 h基本上達到發(fā)酵終點，乙醇濃度達到最高，總糖和還原糖濃度基本上降到最低水平。HI6/6與HPI6/3的最終乙醇濃度分別為55 g/L和52 g/L，均高于出發(fā)菌株49 g/L，較出發(fā)菌株最終乙醇濃度分別提高了12.24%和6.12%，糖醇轉(zhuǎn)化率分別為0.495和0.453，為理論值的 96.9%和 88.6%，雖然 HPI6/3不如 HI6/6的終點乙醇濃度高，但是其發(fā)酵時間縮短了12 h。在發(fā)酵過程中，3株菌的酶活逐漸增高，到60 h基本上達到最高點，其中HI6/6的酶活力最高，達到26 U/mL，明顯高于出發(fā)菌株?？傊?，HI6/6和HPI6/3的發(fā)酵性能均高于出發(fā)菌株，說明菊粉酶基因在釀酒酵母中得到了很好的表達，而 HI6/6的發(fā)酵性能要優(yōu)于HPI6/3。

3 討論

釀酒酵母是生產(chǎn)燃料乙醇的最成熟的菌種，具有生長速度快、乙醇得率高、遺傳背景清楚、生物安全等優(yōu)點，廣泛應用于國內(nèi)外的燃料乙醇生產(chǎn)中。菊芋因其具有抗旱、抗鹽、抗蟲等優(yōu)點成為極具開發(fā)價值的非糧燃料乙醇生產(chǎn)原料。一般認為，普通的釀酒酵母因不產(chǎn)生菊粉酶而不能直接發(fā)酵菊粉生產(chǎn)乙醇[18-19]，但釀酒酵母具有分泌蔗糖轉(zhuǎn)化酶的能力，該酶 (SUC2) 的氨基酸序列與K. marxianus的菊粉酶的氨基酸序列有67%的相似性[20]，表現(xiàn)出部分菊粉酶活力，所以，釀酒酵母能部分地水解菊芋生成乙醇，但殘余總糖較高，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，本文通過采用菊粉酶啟動子和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因 (pgk) 啟動子實現(xiàn)來源于K. marxianus的菊粉酶在釀酒酵母中的高表達。實驗結(jié)果表明，兩種啟動子及目的基因在ho基因位點整合后，不影響菌體的生長，且都能夠啟動菊粉酶基因的表達。其中菊粉酶自身啟動子效率較高，最高菊粉酶酶活達到 86 U/mL，是出發(fā)菌株的 4.6倍；而 pgk啟動子的效率略高于出發(fā)菌株，最高菊粉酶酶活為23.8 U/mL，是出發(fā)菌株的1.5倍。濃度為200 g/L的粗菊芋粉的生料發(fā)酵結(jié)果表明，重組表達菊粉酶的釀酒酵母的乙醇發(fā)酵速度較快，終點乙醇濃度分別為55 g/L和52 g/L，均高于出發(fā)菌株 49 g/L，較出發(fā)菌株最終乙醇濃度分別提高了12.24%和6.12%，糖醇轉(zhuǎn)化率分別為0.495和0.453，為理論值的96.9%和88.6%。為提高終點乙醇濃度，我們嘗試了補料發(fā)酵，當菊芋粉濃度提高到280 g/L時，乙醇的濃度可達到10%以上，發(fā)酵可在60 h完成 (數(shù)據(jù)另文發(fā)表)，表現(xiàn)出潛在的工業(yè)化應用價值。

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