鈍齒棒桿菌N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的克隆表達分析及其重組菌的精氨酸發(fā)酵

徐美娟，張顯，饒志明，楊娟，竇文芳，金堅，許正宏

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

2 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，無錫 214122

L-精氨酸 (L-arginine，簡稱L-Arg) 是一種含胍基的堿性氨基酸，是人體和動物體內(nèi)的半必需氨基酸，也是生物體尿素循環(huán)的一種重要中間代謝物，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中用途廣泛，具有獨特的生理和藥理作用；L-精氨酸還是配制營養(yǎng)或特殊治療用途藥物的重要原料[1]，發(fā)酵法生產(chǎn)精氨酸的研發(fā)是目前國內(nèi)外研究的熱點[1-2]。細菌中從 L-谷氨酸合成精氨酸有3條途徑：線性途徑、循環(huán)途徑及新發(fā)現(xiàn)的利用氨甲?；D(zhuǎn)移酶進行精氨酸生物合成的新途徑[3-5]，如圖1所示。

鈍齒棒桿菌 Corynebacterium crenatum、谷氨酸棒桿菌、嗜熱鏈球菌、假單胞菌等利用經(jīng)濟循環(huán)途徑合成精氨酸，乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(N-Acetylornithine aminotransferase，EC 2.6.1.11) (ACOAT) 在合成 L-精氨酸循環(huán)途徑中催化第 4個酶促反應(yīng)，即催化底物 N-乙酰谷氨酸半醛合成 N-乙酰鳥氨酸，需要 5-磷酸吡哆醛作為輔酶。反應(yīng)方程式如下：

隨著原料氨基酸的需求量日益增長，用傳統(tǒng)誘變育種手段提高L-精氨酸產(chǎn)量已不能滿足日益增長的需要，開始利用DNA重組技術(shù)及代謝工程手段來調(diào)控L-精氨酸相關(guān)代謝途徑，以達到提高產(chǎn)量的目的。C. crenatum SYPA 5-5是本實驗室篩選并經(jīng)過多步傳統(tǒng)誘變得到的一株鈍齒狀、無芽孢的革蘭氏陽性高產(chǎn) L-精氨酸突變菌株[6-7]。本課題組對 C. crenatum的谷氨酸合成精氨酸的代謝途徑相關(guān)酶進行了功能分析及其酶學(xué)性質(zhì)的研究，為進一步對精氨酸合成的發(fā)酵過程優(yōu)化提供理論指導(dǎo)意義，在此基礎(chǔ)上進行加強表達，并對系列重組菌進行發(fā)酵分析。本研究室克隆了來自于高產(chǎn)精氨酸菌株 C. crenatum SYPA 5-5中的乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ACOAT) 編碼基因argD，首先在大腸桿菌中高效表達，利用鎳柱親和層析對表達有活性的重組ACOAT進行純化，對酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究；并構(gòu)建了重組鈍齒棒桿菌/ pJCtac-CcargD (CCD)，在C. crenatum中加強轉(zhuǎn)氨酶的表達，在重組鈍齒棒桿菌CCD進行酶活分析的基礎(chǔ)上進一步對其發(fā)酵產(chǎn)精氨酸進行分析。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

實驗所用菌株及質(zhì)粒見表1。

1.2 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基

大腸桿菌：LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37 ℃，旋轉(zhuǎn)式搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，氨芐青霉素濃度為100 μg/mL，卡那霉素濃度為50 μg/mL篩選轉(zhuǎn)化子，IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.5~1 mmol /L。

圖1 細菌L-精氨酸生物合成途徑Fig. 1 The arginine biosynthesis pathway in bacteria.

表1 本實驗中所用的菌株及質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

鈍齒棒桿菌：LBG培養(yǎng)基 (LB+0.5%葡萄糖)，培養(yǎng)溫度30 ℃，往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵96 h，轉(zhuǎn)化子選用卡那霉素濃度為30 μg/mL篩選。

斜面培養(yǎng)基 (g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，NaCl 10。pH 7.0、115 ℃滅菌15 min。

搖瓶種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖30，玉米漿20，(NH4)2SO420，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.5，尿素1.5。pH 7.0~7.2、121 ℃滅菌20 min，裝液量30 mL/ 250 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖150 (分消)，玉米漿40，(NH4)2SO420，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，生物素8×10?5，L-組氨酸5×10?4，CaCO330。pH 7.0~7.2、121 ℃滅菌10 min，裝液量25 mL/250 mL[9]。

1.3 主要試劑及儀器

質(zhì)粒小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司；工具酶、IPTG購自TaKaRa公司；咪唑和抗生素購自上海Sangon公司；L-精氨酸琥珀酸購自 Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺 (American Promega Corporation)、廣范圍蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自 Fermentas公司；PCR引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為國產(chǎn)試劑純。基因擴增儀 (BioRad公司)，電擊儀 (Eppendorf)，BIOTECH-5BG 5 L發(fā)酵罐 (上海保興)。

1.4 方法

1.4.1 argD基因的克隆

由于C. crenatum的遺傳背景尚不清楚，其與谷氨酸棒桿菌同源性高，因此根據(jù) NCBI中谷氨酸棒

提取C. crenatum SYPA 5-5染色體為模板，PCR擴增條件為：94 ℃，5 min預(yù)變性；94 ℃ 50 s，58 ℃1 min 30 s，72 ℃ 1 min 30 s ，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。所得片段膠回收后與克隆載體pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli JM109，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切鑒定，并將重組質(zhì)粒命名為T-CcargD，測序。

1.4.2 重組大腸桿菌表達載體的構(gòu)建及乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ACOAT) 編碼基因的誘導(dǎo)表達

將T-CcargD進行EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，膠回收argD片段，與經(jīng)相同酶切線性化的pET-28a(+) 載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)酶切驗證，挑選陽性轉(zhuǎn)化子接種至含卡那霉素(終濃度為50 μg/mL) 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1%接種量轉(zhuǎn)接，至OD600約0.6~0.8時加入IPTG進行 16 ℃過夜誘導(dǎo)表達[10]。

1.4.3 重組大腸桿菌-鈍齒棒桿菌穿梭表達載體的構(gòu)建

將T-CcargD進行SalⅠ、BamHⅠ雙酶切，膠回收argD片段，與相同酶切的線性化載體pJC-tac連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli JM109，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒驗證后備用。

1.4.4 SDS-PAGE

采用5%的濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳，考馬斯亮蘭R-250染色。桿菌C. glutamicum ATCC 13032的全基因組核苷酸序列中1 176 bp argD基因序列 (GenBank Accession No. BA000036.3)，設(shè)計乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因的引物如表2所示。

表2 本實驗中所用的引物Table 2 Primers used in this study

1.4.5 乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的純化

誘導(dǎo)表達的菌液于10 000 r/min、4 ℃離心收集菌體，進行超聲波破碎細胞，PBS緩沖液 (pH 7.4)懸浮菌體，0.45 μm濾膜過濾后上柱，經(jīng) Ni-NTA純化[10]。

1.4.6 乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶活力的測定[11-14]

酶反應(yīng)體系：0.5 mL反應(yīng)液含100 mmol磷酸鉀緩沖液 (pH 9.5) (加入不同濃度的 K2HPO4、KH2PO4或由KOH調(diào)節(jié)至目標(biāo)pH值)，10 mmol N-乙酰-L-鳥氨酸，5 mmol α-酮戊二酸鉀，0.5 mmol 5-磷酸吡哆醛及適量酶液。37 ℃水浴15 min后加入0.2 mL反應(yīng)終止液 (10 mol/L HCl)，終止反應(yīng)后沸水浴45 min，冷卻至室溫后離心，上清加入1 mL 3.6 mmol的醋酸鈉和0.2 mL 10 mmol的鄰氨基苯甲醛，室溫顯色15 min，測定440 nm下的吸光值。產(chǎn)物5-吡咯羧酸440 nm的摩爾吸光系數(shù)為1.9×103L/(mol·cm)。本實驗利用精氨酸合成途徑中的逆向反應(yīng)，采用N-乙酰-L-鳥氨酸和α-酮戊二酸鉀為底物，5-磷酸吡哆醛為輔酶，有明顯的黃色反應(yīng)則為有酶活。其原理是利用鄰氨基苯甲醛和酶促反應(yīng)產(chǎn)物自身環(huán)化脫乙?；?5-吡咯羧酸產(chǎn)生黃色反應(yīng)，440 nm下測定光吸收值。

一個ACOAT活力單位 (U) 定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化α-酮戊二酸鉀生成1 μmol產(chǎn)物環(huán)化后生成5-吡咯羧酸所需的酶量。

1.4.7 蛋白質(zhì)含量測定

酶液蛋白含量采用Bradford法[16]測定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4.8 乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

最適pH及pH穩(wěn)定性：配制pH 4.0~12.0的反應(yīng)緩沖液，30 ℃下將酶分別與不同pH的反應(yīng)液混合，測定ACOAT在不同pH體系中酶活，觀察pH對酶促反應(yīng)的影響。再將一定量的酶液加入到以上不同pH的反應(yīng)緩沖液中，30 ℃保溫1 h，測定剩余酶活，觀察ACOAT在不同pH條件下的穩(wěn)定性。

最適溫度及熱穩(wěn)定性：采用pH 7.0反應(yīng)液，分別在4 ℃、15 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、45 ℃，55 ℃、65 ℃、80 ℃溫度下測定酶活，研究溫度對酶的影響。將酶液置于以上不同溫度下保溫1~5 h，測定剩余酶活，觀察ACOAT在不同溫度下的穩(wěn)定性。

不同金屬離子、EDTA及精氨酸和鳥氨酸的添加對酶活的影響：在反應(yīng)液中分別加入終濃度為1 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+、Li+、Ni2+、Mn2+、Zn2+、Na+以及EDTA、L-鳥氨酸、L-精氨酸，30 ℃下測定ACOAT酶活，以不另加任何物質(zhì)的反應(yīng)液作為對照，研究不同金屬離子對酶促反應(yīng)的影響[17]。

1.4.9 重組鈍齒棒桿菌的獲得

采用電擊轉(zhuǎn)化法[18]將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化鈍齒棒桿菌，涂布含有30 μg/mL卡那霉素的固體LBG平板于30 ℃培養(yǎng)36 h，挑取轉(zhuǎn)化子驗證后于斜面保藏。

1.4.10 鈍齒棒桿菌的發(fā)酵

從斜面挑取一環(huán)菌體接種種子培養(yǎng)基，30 ℃于往復(fù)搖床培養(yǎng)15~16 h。5 L發(fā)酵罐發(fā)酵：5 L發(fā)酵罐中裝液量3 L，接種量5%，通風(fēng)量3 L/min，流加氨水控制pH 7.0，攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min，30 ℃發(fā)酵96 h。

1.4.11 菌體生長的測定

發(fā)酵液用0.25 mol/L的鹽酸稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，測定 562 nm處的光密度，按照 1 OD=0.375 g/L DCW，換算為菌體干重 (文中以DCW表示)[7,17]。

1.4.12 發(fā)酵液中還原糖的測定

采用SBA-40B生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中葡萄糖濃度[19]。

1.4.13 氨基酸含量的測定

采用坂口試劑法測定精氨酸[20-21]及氨基酸自動分析儀測定發(fā)酵液中氨基酸含量。

2 結(jié)果

2.1 鈍齒棒桿菌argD基因的克隆及分析

以C. crenatum SYPA5-5基因組DNA為模板，引物P1、P2進行PCR擴增，得到大小1 176 bp、編碼390個氨基酸的基因片段，連接至pMD18-T載體測序，比對結(jié)果表明C. crenatum SYPA argD基因與C. glutamicum ATCC 13032 argD同源性為99.32%，相差8個堿基，4個氨基酸。C. crenatum SYPA 5-5基因 argD核苷酸序列已提交 GenBank數(shù)據(jù)庫(Accession No. HQ602711)。

2.2 重組大腸桿菌BL21 (pET-28a-argD) 的構(gòu)建

將 T-CcargD用 EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，回收argD片段后，與線性化pET-28a(+) 連接后轉(zhuǎn)化，陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒經(jīng) EcoRⅠ、XhoⅠ酶切驗證，釋放5 369 bp和約1 176 bp大小的片段，分別對應(yīng)pET-28a(+) 和argD的大小，結(jié)果表明質(zhì)粒pET-28a-CcargD構(gòu)建成功。

2.3 CcargD基因在E. coli BL21 (DE3) 中表達與重組蛋白ACOAT的純化

重組菌pET-28a(+)-CcargD/BL21 (DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)表達菌液經(jīng)超聲破碎取上清SDS-PAGE分析，檢測到分子量約為42 kDa的特異性條帶，如圖2所示。上清液測得酶活為65.7 U/g，約為對照菌株BL21粗酶液酶活的6倍，說明argD基因在大腸桿菌中表達，乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶具生物學(xué)活性。采用 Ni-NTA親和層析，純化后ACOAT酶液比酶活為108.2 U/g，回收率達77.8%，結(jié)果見表3。

2.4 乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

由圖3可知重組酶的最適反應(yīng)pH為8.0，但在pH 6.0~9.0范圍內(nèi)酶活均處于較高的水平，在酸性和強堿的條件下，酶活損失嚴(yán)重。將 ACOAT在pH 6.0~10.0處理1~5 h后測定酶活性，在pH 7.0、8.0、9.0、10.0時保溫1 h后的酶活力均能保持85%以上的酶活力，說明 ACOAT在弱堿性環(huán)境下相對穩(wěn)定，而重組酶保存在pH值為8.0的緩沖液條件下穩(wěn)定性最佳 (圖4)。

圖2 重組菌全細胞蛋白及ACOAT純化后SDS-PAGE電泳分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of proteins in whole cells and ACOAT purification. 1: supernatant of E. coli BL21 with plasmid pET-28a(+); 2,3: supernatant of E. coli BL21 with recombinant plasmid pET-28a(+)-CcargD; 4: protein markers (kDa); 5: purified ACOAT.

2.4.2 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

如圖5所示，在4 ℃~80 ℃范圍內(nèi)進行酶促反應(yīng)，最適反應(yīng)溫度為30 ℃，而已報道的腸桿菌屬的乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的最適反應(yīng)溫度為 37 ℃[9]。在20 ℃、25 ℃、37 ℃酶活力相似約為在30 ℃條件下的97%；由圖6可知，37 ℃保溫5 h后有74%活力，55 ℃保溫5 h后仍留有69%活力，表明該酶熱穩(wěn)定性較好。ACOAT在4 ℃~40 ℃較穩(wěn)定，保溫1 h后相對酶活仍在80%以上，隨著溫度的升高，酶穩(wěn)定性逐漸下降，到達65 ℃時ACOAT幾乎完全失活，且檢測不到酶活，說明酶已完全失活。

表3 重組酶乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶純化表Table 3 Purification of recombinant ACOAT

圖3 pH對轉(zhuǎn)氨酶活力的影響Fig. 3 Effect of pH on enzymatic transamination.

圖4 乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的pH穩(wěn)定性Fig. 4 pH stability of N-Acetylornithine aminotransferase.

圖5 溫度對轉(zhuǎn)氨酶活力的影響Fig. 5 Effect of temperature on enzymatic transamination.

圖6 乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的熱穩(wěn)定性Fig. 6 Thermal stability of N-Acetylornithine aminotransferase.

2.4.3 金屬離子及EDTA對ACOAT酶促反應(yīng)的影響

金屬離子可作為酶促反應(yīng)的輔助因子，在酶促反應(yīng)中常添加一些金屬離子。在 ACOAT酶促反應(yīng)添加金屬離子以及 EDTA，以不加離子的反應(yīng)液作為對照設(shè)其酶活為100%，離子對ACOAT酶活的影響結(jié)果見表 4。Ni2+對轉(zhuǎn)氨酶的酶活力有明顯促進作用；Mn2+、Cu2+、Fe3+等加入后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，酶活較低，此時酶蛋白大多已失活；Na+、Li+、NH4+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+及EDTA對酶促反應(yīng)影響較??；Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+均具有一定抑制作用。

2.4.4 精氨酸、鳥氨酸對ACOAT酶促反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系中添加終濃度為1 mmol/L的L-精氨酸以及L-鳥氨酸 (該酶在以L-精氨酸和L-鳥氨酸為底物時沒有轉(zhuǎn)氨活性)，測定代謝途徑相關(guān)氨基酸對ACOAT酶活影響，分別測得酶活為 104.9 U/g和118.9 U/g，說明 L-鳥氨酸的添加對鈍齒棒桿菌ACOAT催化底物N-乙酰鳥氨酸與α-酮戊二酸生成N-乙酰谷氨酸半醛的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)起促進作用，酶活提高 9.89%；L-精氨酸的添加對其酶促反應(yīng)幾乎沒有影響，說明此酶不受終產(chǎn)物反饋抑制。

2.5 重組鈍齒棒桿菌C. crenatum (pJCtac-CcargD)的構(gòu)建

構(gòu)建重組質(zhì)粒pJCtac-CcargD同上文，經(jīng)SalⅠ、BamHⅠ雙酶切，釋放約6 400 bp和1 100 bp大小的片段，分別對應(yīng)于pJCtac和argD的大小，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。電擊轉(zhuǎn)化C. crenatum SYPA，在含卡那霉素的 LBG平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子 C. crenatum (pJCtac-CcargD)。

2.6 重組鈍齒棒桿菌的獲得及其與 C. crenatum SYPA中ACOAT酶活力比較

研究發(fā)現(xiàn) IPTG的添加對菌體生長具有一定的毒性，由于tac啟動子在鈍齒棒桿菌中未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)即有本底表達，因此以下重組菌的發(fā)酵中選擇不添加IPTG。挑選一組C. crenatum (pJCtac-CcargD)轉(zhuǎn)化子和出發(fā)菌株C. crenatum SYPA接種于LBG培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基18 h后收集菌體，經(jīng)超聲波破碎，測定粗酶液中 ACOAT酶活，選擇其中3組數(shù)據(jù)如表5所示?？梢钥闯?，重組菌粗酶液的轉(zhuǎn)氨酶活力顯著提高，其中以 3號轉(zhuǎn)化子提高最多，提高了 84.4%，證明了重組菌 ACOAT表達量加強。

2.7 重組菌 C. crenatum (pJCtac-CcargD) 與 C. crenatum SYPA 5-5發(fā)酵產(chǎn)精氨酸比較

挑取酶活提高較多的 8個重組菌 C. crenatum (pJCtac-CcargD) 和出發(fā)菌株C. crenatum SYPA同時搖瓶發(fā)酵，將8個轉(zhuǎn)化子分別命名為CCD (1~8)，每個轉(zhuǎn)化子取 3個平行，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸比較。將產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化子命名為 CCD1和出發(fā)菌株 C. crenatum SYPA 5-5進行5 L發(fā)酵罐發(fā)酵，每隔8 h取樣對OD、殘?zhí)羌爱a(chǎn)酸進行跟蹤測定，多次發(fā)酵結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子CCD1產(chǎn)酸穩(wěn)定，取3次發(fā)酵數(shù)據(jù)繪制圖 7，由圖可知 CCD1較出發(fā)菌株 C. crenatum SYPA 5-5在生長前期稍慢，對數(shù)生長期后兩者生長狀態(tài)已基本趨于一致；40 h到96 h為菌體生長的穩(wěn)定期也是精氨酸積累的關(guān)鍵時期，此時重組菌CCD1發(fā)酵產(chǎn)酸優(yōu)勢趨于明顯，精氨酸生成率明顯提高，至發(fā)酵結(jié)束時產(chǎn)量達到最高達39.7 g/L，較出發(fā)菌株C. crenatum SYPA產(chǎn)酸34.6 g/L提高了14.7%。由耗糖曲線可以看出重組菌的耗糖能力從16 h開始便強于對照出發(fā)菌株，到發(fā)酵96 h時葡萄糖殘留量都為 0。結(jié)果表明加強精氨酸合成代謝途徑中的轉(zhuǎn)氨酶表達可以增強精氨酸合成的代謝流從而對增強L-精氨酸的合成途徑有一定的加強作用，但提高幅度不大。由圖7 (E) 可知發(fā)酵溶氧曲線，argD的增強表達對菌株的溶氧水平的影響較顯著，重組菌CCD1與對照菌株 SYPA相比從發(fā)酵起始溶氧曲線始終保持較低水平，說明重組菌發(fā)酵罐內(nèi)氧氣利用較多，說明菌體中argD的加強表達提高菌體氧利用率顯著。

表4 金屬離子及EDTA對ACOAT酶活性的影響Table 4 Effect of metal ion and EDTA on the activity of ACOAT

表5 重組菌與原始C. crenatum SYPA ACOAT酶活力分析比較Table 5 Comparison of ACOAT enzyme activities in the CCD (pJCtac-CcargD/C. crenatum) and C. crenatum SYPA

圖7 重組菌CCD1 (pJCtac-CcargD/C. crenatum) 與原始菌株的發(fā)酵曲線Fig. 7 Comparison of L-arginine production between the CCD1 (pJCtac-CcargD/C.crenatum) and C. crenatum SYPA. (A) Cell concentration. (B) Glucose concentration. (C) L-arginine concentration. (D) L-arginine production rate. (E) The dissolved oxygen (DO) changing patterns.

3 討論

本文首先研究了精氨酸合成代謝途徑中N-乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶的酶學(xué)性質(zhì)，C. crenatum ACOAT在弱堿性酶活相對穩(wěn)定，而來自于E. coli和Klebsiella aerogenes的ACOAT的酶學(xué)性質(zhì)最適溫度為37 ℃，最適 pH為 6.5和 7.0[13,22-23]，本課題組還分析了此代謝途徑中其他酶的性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)argC-argH編碼的7個酶最適pH都在6.5~8.0之間，從酶促反應(yīng)的角度解釋了精氨酸發(fā)酵過程需要維持pH 7.0~7.5。還發(fā)現(xiàn)了Ni2+的促進作用和 Zn2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+的抑制作用，這為深入研究其蛋白結(jié)構(gòu)和作用機理，以便更清晰了解C. crenatum SYPA精氨酸合成途徑奠定了基礎(chǔ)，同時為改良發(fā)酵工藝和培養(yǎng)基的優(yōu)化進一步提高產(chǎn)酸提供了可靠理論依據(jù)；本研究還發(fā)現(xiàn)了鳥氨酸的添加對 ACOAT的酶活具有一定的激活作用，但其作用機理將在對ACOAT進行蛋白結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上進行分析，相關(guān)研究正在進行。

另外，利用代謝工程提高L-精氨酸產(chǎn)量最重要的策略之一是提高關(guān)鍵酶酶量，郝寧等在加強了鈍齒棒桿菌中合成精氨酸關(guān)鍵酶基因N-乙酰谷氨酸激酶表達后其產(chǎn)量提高了25%[24]。本課題組同樣也對C. crenatum SYPA 5-5的精氨酸合成關(guān)鍵酶基因argB進行了加強表達研究，重組菌CCB產(chǎn)酸量提高較明顯，提高幅度為 23.4%，與郝寧等的研究結(jié)果相似。本文通過增加轉(zhuǎn)氨酶編碼基因表達量，較出發(fā)菌株ACOAT酶活提高了84%；發(fā)現(xiàn)ACOAT的增強表達對菌株溶氧水平影響顯著，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)溶氧在精氨酸的合成中起重要作用，高溶氧條件下精氨酸的產(chǎn)量明顯高于低溶氧條件下的產(chǎn)酸量[7]，重組菌 CCD1在發(fā)酵精氨酸過程中氧利用率明顯高于對照菌株，從實驗結(jié)果來看，重組菌精氨酸產(chǎn)量提高一方面是由于 argD的過量表達增強了精氨酸合成代謝流，另一方面是由于菌體自身氧利用率提高，從而使得重組菌精氨酸的產(chǎn)量提高了14.7%。本研究為構(gòu)建高產(chǎn)精氨酸重組基因工程菌提供理論依據(jù)，具有一定的指導(dǎo)意義。另外本文證明了加強合成代謝途徑中某一種酶 (關(guān)鍵酶/非關(guān)鍵酶) 的表達既可以增強產(chǎn)物合成代謝流量，也可能改變菌體的某些其他發(fā)酵性能，這為氨基酸代謝研究提供了一定的實踐參考。

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