過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶對大腸桿菌NZN111產(chǎn)丁二酸的影響

梁麗亞，馬江鋒，劉嶸明，王光明，徐冰，張敏，姜岷

南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009

丁二酸 (又稱琥珀酸)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS) 類生物可降解材料，被美國能源部認(rèn)為是未來 12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一[1-2]。利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源生產(chǎn)丁二酸，價(jià)格低廉、污染小，且在發(fā)酵過程中可吸收固定 CO2，開辟了溫室氣體利用的新途徑，近年來成為研究的熱點(diǎn)。

丁二酸的生產(chǎn)菌株很多，目前研究的熱點(diǎn)主要集中在產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌 Anaerobiospirillum succiniciproducens[3]、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes[4]、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌 Mannheimia succiniciproducens[5]和重組大腸桿菌 Escherichia coli[6-7]。利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進(jìn)程。大腸桿菌由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。圖1是大腸桿菌的厭氧混合酸發(fā)酵途徑[8]。產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因改造策略主要有：增強(qiáng)代謝途徑中的關(guān)鍵酶 (如PPC)、失活或敲除競爭途徑中的酶 (如LDH、PFL)、引入新的代謝途徑 (如乙醛酸循環(huán)) 等[9]。

圖1 大腸桿菌厭氧混合酸發(fā)酵途徑[8]Fig. 1 Pathways of anaerobic mixed acid fermentation for Escherichia coli[8].

大腸桿菌 NZN111由于缺乏了乳酸脫氫酶的編碼基因 (ldhA) 和丙酮酸-甲酸裂解酶的編碼基因(pflB) 而使副產(chǎn)物乳酸和甲酸的生產(chǎn)途徑阻斷，具有潛在生產(chǎn)丁二酸的能力。但同時(shí)由于NADH依賴的乳酸脫氫酶 (LDH) 無法合成而限制了糖酵解過程中形成的NADH再生為NAD+的過程，造成輔酶不平衡，導(dǎo)致該菌株厭氧條件下不能利用葡萄糖進(jìn)行生長。其中 Stols和 Donnelly[10-11]將大腸桿菌中NAD+依賴的蘋果酸酶過量表達(dá)于E. coli NZN111后可以進(jìn)行丁二酸的厭氧發(fā)酵，初始20 g/L葡萄糖產(chǎn)生12.8 g/L丁二酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到64%，本實(shí)驗(yàn)是通過過量表達(dá)另一個(gè) NAD+依賴的蘋果酸脫氫酶使重組菌恢復(fù)了厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，且通過測定細(xì)胞干重及輔酶NAD(H) 的含量從而驗(yàn)證了輔酶不平衡導(dǎo)致E. coli NZN111無法代謝葡萄糖的假設(shè)。Hong和Lee選擇還原性糖山梨醇作為碳源，當(dāng)以CO2為氣相時(shí)，20 g/L山梨醇發(fā)酵產(chǎn)生10 g/L丁二酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%[12-13]。

蘋果酸脫氫酶 (MDH) 在厭氧條件下主要催化草酰乙酸 (OAA) 到蘋果酸 (Malate) 的反應(yīng)過程，該過程伴隨著 1分子的 NADH再生為一分子的NAD+，在E. coli NZN111中過量表達(dá)該基因?qū)⒂欣贜ADH再生為NAD+，從而維持該菌株胞內(nèi)的輔酶平衡，恢復(fù)其在厭氧條件下的生長及耗糖能力，促進(jìn)丁二酸的合成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pTrc99a由南京師范大學(xué)邵蔚藍(lán)教授惠贈；E. coli NZN111 (ldhA::Kan Pfl::cam) 由南伊利諾伊卡本代爾大學(xué)Clark教授惠贈，作為宿主菌和對照菌。

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素、氯霉素、硫酸卡那霉素，購自上海生工生物工程有限公司；基因組提取試劑盒和瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Pyrobest DNA聚合酶和T4 DNA連接酶為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨為 Oxoid公司產(chǎn)品；CO2氣體購自南京上元工業(yè)氣體廠；發(fā)酵罐購自美國NBS公司BIOFLO110系列7 L發(fā)酵罐。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 mdh基因的克隆

引物設(shè)計(jì)：參照MDH基因序列 (來源于E. coli K12 基因組，Gene Accession No. ECK3225) 設(shè)計(jì)，由上海申能博彩生物科技有限公司合成。分別在上下游引物的 5′端引入了 EcoRⅠ和 HindⅢ限制性酶切位點(diǎn) (下劃線標(biāo)示)，引物序列如下：Forward (5′?3′)：GGAATTC ACACATTCTTGAGATGTGGTC ATT；Reverse (5′?3′)：CCCAAGCTT AATATCCGGC AACCAATTAAGTC。PCR反應(yīng)體系：上下游引物(50 pmol/μL) 各1 μL；模板DNA (100 ng/μL) 0.5 μL；l0倍緩沖液5 μL；dNTPs (10 mmol/L) 1 μL；DNA聚合酶 (2.5 U/μL) 1 μL；ddH2O 38.5 μL，總體積50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 45 s，55 ℃45 s，72 ℃ 1 min ，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將純化后的mdh基因片段以及質(zhì)粒pTrc99a進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切反應(yīng)，把雙酶切后得到的片段在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTrc99a-mdh并轉(zhuǎn)化于E. coli NZN111中。涂布含氯霉素、硫酸卡那霉素和氨芐青霉素平板后挑選抗性克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行HindⅢ單酶切及EcoRⅠ和HindⅢ的雙酶切鑒定。

1.2.3 重組蘋果酸脫氫酶的誘導(dǎo)表達(dá)

菌體轉(zhuǎn)化：CaCl2法[14]。有氧誘導(dǎo)：37 ℃、200 r/min培養(yǎng)菌體到OD600約0.6左右，加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L，30 ℃、170 r/min誘導(dǎo)8 h。

1.2.4 酶活檢測

樣品處理：采取超3 s停5 s的策略共超聲破碎3 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清即粗酶液，測定酶活并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

總蛋白濃度測定按照 Bradford法[15]，以 BSA (牛血清白蛋白) 為標(biāo)準(zhǔn)。

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系如下[16]：0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)，0.2 mmol/L的NADH，2 mmol/L的草酰乙酸。30 ℃連續(xù)監(jiān)測340 nm處吸光值的變化，根據(jù)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成底物濃度。

酶活定義為：30 ℃時(shí)1 min內(nèi)催化1 μmol的草酰乙酸轉(zhuǎn)化為蘋果酸所需要的酶量，即1 U。比酶活定義為每毫克蛋白含有的酶活 (U/mg)。

1.2.5 輔酶NADH與NAD+濃度的測定

[17]方法：反應(yīng)時(shí)依次添加 150 μL上述的細(xì)胞提取液、0.9 mL的純水、1.8 mL的混合反應(yīng)液 (等體積的1.0 mol/L Bicine buffer、純乙醇、40 mmol/L EDTA、4.2 mmol/L MTT和雙倍體積的16.6 mmol/L PES混合，30 ℃水浴10 min) 和150 μL的乙醇脫氫酶 (500 U/mL)，迅速混勻后，測定波長570 nm處的吸光度值A(chǔ)570，將A570隨時(shí)間變化曲線斜率帶到標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測樣品中NADH與NAD+的濃度。

1.2.6 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.0，氯霉素、硫酸卡那霉素和氨芐青霉素的終濃度分別為25、30、100 μg/mL。

30 mL LB液體培養(yǎng)基，添加0.48 g堿式碳酸鎂，20 g/L葡萄糖，抗生素添加同有氧培養(yǎng)，添加終濃度為0.3 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷) 以誘導(dǎo)表達(dá)MDH。

3 L發(fā)酵液組成：LB培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)階段添加抗生素濃度同上，5 mol/L NaOH外源流加調(diào)節(jié)pH值至7.0，根據(jù)需要補(bǔ)加葡萄糖。厭氧發(fā)酵階段采用分批補(bǔ)料的方式補(bǔ)加葡萄糖，并加入滅過菌的堿式碳酸鎂內(nèi)源調(diào)節(jié)pH值為6.80。

1.2.7 培養(yǎng)方法

有氧搖瓶培養(yǎng)：將保存于?80 ℃的菌種在加有相應(yīng)抗生素的平板上活化，挑單菌落到5 mL LB試管，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)10 h，1%接種量接種到好氧培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h。

厭氧血清瓶發(fā)酵：轉(zhuǎn)接 10%的菌液到血清瓶中，通入過濾除菌后的CO2氣體2 min，保證血清瓶中為厭氧環(huán)境，厭氧發(fā)酵30 ℃、170 r/min，發(fā)酵周期48 h。

7 L發(fā)酵罐兩階段發(fā)酵：在發(fā)酵罐上采用的是先在有氧條件下通入無菌空氣來培養(yǎng)菌體，37 ℃、500 r/min振蕩培養(yǎng)，初始葡萄糖濃度為10 g/L，當(dāng)葡萄糖幾乎耗盡時(shí)開始以低流速2.0 g/(L·h) 流加600 g/L的葡萄糖，當(dāng)OD600達(dá)到16左右時(shí)，以0.5 L/min的流速通入CO2氣體，37 ℃，200 r/min，補(bǔ)加葡萄糖，使厭氧起始葡萄糖濃度為15 g/L左右，并加入48 g滅菌后的堿式碳酸鎂。

1.2.8 發(fā)酵及代謝物分析

細(xì)胞生長是用紫外可見分光光度計(jì)于波長600 nm處測定吸光度值，細(xì)胞干重 (DCW) 是由DCW與OD600測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到，換算公式為：DCW (g/L)=0.4×OD600。培養(yǎng)基中的葡萄糖用生物傳感儀 (SBA40C) (生產(chǎn)廠家是山東省科學(xué)院生物研究所) 檢測，有機(jī)酸用高效液相色譜法(HPLC) 檢測，色譜柱為Prevail Organic Acid，流動相為25 mmol/L KH2PO4，pH 2.5，流速1.0 mL/min，紫外檢測波長215 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果酸脫氫酶 (MDH) 的克隆與表達(dá)

將 PCR擴(kuò)增后的目的基因片段 mdh和載體pTrc99a分別進(jìn)行EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切 (圖2)，酶切產(chǎn)物純化后用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pTrc99a-mdh。

圖2 質(zhì)粒pTrc99a和mdh的雙酶切鑒定Fig. 2 Identification of pTrc99a and mdh by restriction endonuclease digestion. M: DNA marker; 1: pTrc99a digested with EcoR I and Hind III (4 125 bp); 2: mdh digested with EcoR I and Hind III (939 bp).

重組質(zhì)粒經(jīng)單、雙酶切鑒定 (圖 3)，結(jié)果與預(yù)期一致。進(jìn)行測序后發(fā)現(xiàn)目的基因序列與公布的序列100%匹配。

2.2 MDH酶活測定

37 ℃、200 r/min培養(yǎng)菌體到OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.3 mmol/L，30 ℃、170 r/min誘導(dǎo) 8 h后對出發(fā)菌株和構(gòu)建的重組菌株進(jìn)行粗酶液的相應(yīng)酶活測定，計(jì)算出粗酶液的比酶活，結(jié)果如表1所示。

由表 1可知：重組菌蘋果酸脫氫酶比酶活最高為39.84 U/mg，而對應(yīng)的受體菌僅為3.112 U/mg，重組菌的比酶活提高了 11.8倍，E. coli NZN111/ pTrc99a的比酶活為3.074 U/mg，重組菌的比酶活提高了12倍，可見重組菌中的蘋果酸脫氫酶基因得到了過量表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒pTrc99a-mdh的酶切鑒定Fig. 3 Identification of pTrc99a-mdh by enzyme digestion. M: DNA marker; 1,2: pTrc99a-mdh digested with Hind III; 3,4: pTrc99a-mdh digested with EcoR I and Hind III.

2.3 厭氧搖瓶發(fā)酵

有氧培養(yǎng)菌液10%轉(zhuǎn)接厭氧血清瓶，48 h后測定細(xì)胞干重、MDH的酶活及輔酶NAD+/NADH的量，并測定殘?zhí)羌坝袡C(jī)酸的含量。結(jié)果如表2所示。

由表 2可知，過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶恢復(fù)了厭氧條件下E. coli NZN111的生長，重組菌細(xì)胞干重是對照菌的 3.8倍，在一定程度上也恢復(fù)了出發(fā)菌株代謝葡萄糖的能力，48 h內(nèi)可以消耗10 g/L的葡萄糖，產(chǎn)2.5 g/L的丁二酸，而對照菌幾乎沒有丁二酸生成。MDH比酶活提高了14.8倍。輔酶 NAD+與NADH的總量提高了2倍，NADH/NAD+的比例由0.64降低為0.30。

表1 對照菌與重組菌的蛋白濃度、MDH酶活及比酶活Table 1 Concentration of protein, enzyme activity and specific enzyme activity of MDH in the control strain and in the recombinant strain

厭氧搖瓶分別于18 h、28 h和48 h結(jié)束培養(yǎng)，分別測定細(xì)胞干重 (DCW)、耗糖及 NAD(H) 的含量，進(jìn)而計(jì)算NADH/NAD+，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出18 h時(shí)重組菌E. coli NZN111/ pTrc99a-mdh與對照菌E. coli NZN111的DCW均未有所增加，兩者均未耗糖，NADH/NAD+均為 0.65左右。發(fā)酵28 h和48 h后，E. coli NZN111/pTrc99amdh的DCW比對照菌分別提高了1.2倍和1.8倍，耗糖分別提高了2倍和7倍，說明過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶恢復(fù)了E. coli NZN111厭氧條件下的生長及耗糖能力。圖 4C顯示，28 h和 48 h時(shí) E. coli NZN111/pTrc99a-mdh NADH/NAD+分別為 0.26和0.33，而對照菌NADH/NAD+均為0.76，說明過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶使NADH氧化為NAD+，恢復(fù)了氧化還原平衡，從而恢復(fù)了其厭氧條件下的生長及耗糖能力。

表2 厭氧血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定結(jié)果Table 2 Results of these parameters on anaerobic fermentation in sealed bottles

圖4 不同時(shí)間E. coli NZN111/pTrc99a-mdh與E. coli NZN111細(xì)胞干重 (A)、耗糖 (B) 和NADH/NAD+ (C) 的比較Fig. 4 Comparision of DCW (A), consumed glucose (B) and NADH/NAD+ (C) between E. coli NZN111/pTrc99a-mdh and E. coli NZN111 at different time. DCW: dry cell weight.

2.4 兩階段發(fā)酵

有氧培養(yǎng)可快速提高菌體密度，從而提高發(fā)酵過程的生產(chǎn)強(qiáng)度，本研究將重組菌株先有氧培養(yǎng)至細(xì)胞干重達(dá)到6.4 g/L，然后通入CO2轉(zhuǎn)成厭氧發(fā)酵狀態(tài)，并加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG。每隔2小時(shí)取樣測 OD600、殘?zhí)遣⒘魳訙y有機(jī)酸含量 (圖5)。轉(zhuǎn)厭氧后15 h，葡萄糖消耗為14.75 g/L，丁二酸濃度達(dá)到15.18 g/L，丁二酸的得率為1.03 g/g葡萄糖，丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為1.012 g/(L·h)。

圖5 E. coli NZN111/pTrc99a-mdh在7 L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵階段的細(xì)胞干重 (DCW)、葡萄糖及產(chǎn)物濃度Fig. 5 DCW, the concentrations of glucose and the organic acids in E. coli NZN111/pTrc99a-mdh after transition to anaerobic-phase fermentation in a 7 L fermentor. DCW: dry cell weight.

3 討論

本研究構(gòu)建了重組大腸桿菌 NZN111/pTrc99amdh，有氧誘導(dǎo)時(shí)比酶活比對照菌提高了 11.8倍。厭氧搖瓶發(fā)酵過程中通過添加終濃度為0.3 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)使蘋果酸脫氫酶在大腸桿菌 NZN111胞內(nèi)得到過量表達(dá)，蘋果酸脫氫酶 (MDH) 酶活較對照菌提高了14.8倍，NADH/NAD+的比例從0.64減少到0.26，同時(shí)NADH與NAD+的總量提高了2倍，恢復(fù)了厭氧條件下E. coli NZN111的生長及耗糖能力。通過兩階段發(fā)酵，厭氧發(fā)酵階段，15 h內(nèi)葡萄糖消耗為14.75 g/L，丁二酸濃度達(dá)到15.18 g/L，丁二酸的得率為1.03 g/g葡萄糖，丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度為1.012 g/(L·h)。與國內(nèi)外有關(guān)大腸桿菌NZN111研究報(bào)道的發(fā)酵結(jié)果相比，通過過量表達(dá)蘋果酸脫氫酶后進(jìn)行兩階段發(fā)酵，丁二酸的得率及丁二酸的生產(chǎn)強(qiáng)度都有很大提高，為丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一個(gè)新的平臺。

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