阻斷集胞藻6803 PHB合成途徑提高胞內(nèi)NADPH含量

解鵑，周杰，張海峰，李寅

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

藍(lán) 藻 (Blue-green algae) 又 稱 藍(lán) 細(xì) 菌(Cyanobacteria)，是一類能進(jìn)行放氧光合作用的光合自養(yǎng)原核生物，能夠利用二氧化碳和太陽(yáng)能快速繁殖。此外，藍(lán)藻具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景清楚、易于基因操作等特點(diǎn)。因此，隨著全球能源匱乏及氣候變暖的加劇，藍(lán)藻成為生產(chǎn)可再生化學(xué)品的潛在理想宿主。通過基因工程改造，已實(shí)現(xiàn)在藍(lán)藻中生產(chǎn)異丁醛、乙醇和氫等化學(xué)品[1-5]。但由于產(chǎn)量低，限制了藍(lán)藻化學(xué)品在工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。

集胞藻6803是一種單細(xì)胞藍(lán)藻，已于1996年首次完成了基因組序列的測(cè)定，遺傳背景清楚，易于操作。所以本研究對(duì)集胞藻6803進(jìn)行代謝途徑改造。

還原力NADPH是參與生物能量及碳代謝的重要輔助因子，具體包括參與微生物細(xì)胞內(nèi)還原型生物合成、抗氧化、氧化脅迫等多個(gè)氧化還原反應(yīng)[6-7]。目前，改變還原力流向已成為提高工業(yè)微生物化學(xué)品產(chǎn)量的有效方法[8]。近年來的研究進(jìn)展表明，通過代謝工程改造提高胞內(nèi)NADPH含量可提高需NADPH依賴型關(guān)鍵酶催化合成的化合物產(chǎn)量，如 L型氨基酸、脂類、多酚等[9-11]。因此，通過代謝工程改造提高細(xì)胞內(nèi)NADPH含量將有利于集胞藻生產(chǎn)化學(xué)品。

聚羥基脂肪酸 (Polyhydroxyalkanoate，簡(jiǎn)稱PHA) 是一類廣泛存在于微生物中的高分子聚脂，其中聚-β-羥基丁酸酯 (Poly-β-Hydroxybutyrate，簡(jiǎn)稱 PHB) 是最常見的一種。在正常生長(zhǎng)條件下，有些藍(lán)藻細(xì)胞可以積累少量PHB作為碳源和能量?jī)?chǔ)藏物質(zhì)[12]。在限氮條件下，流向PHB合成途徑的碳源增加，PHB含量可達(dá)藍(lán)藻細(xì)胞干重的38%[13-14]。根據(jù)已報(bào)道的研究結(jié)果[12,19]，PHB作為細(xì)胞內(nèi)的碳源和能源儲(chǔ)備物質(zhì)，有利于細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境，增強(qiáng)生存能力。目前尚未有關(guān)于 PHB合成途徑敲除對(duì)細(xì)胞影響的報(bào)道。由圖 1集胞藻 PHB合成途徑示意圖[13]可知，PHB是由乙酰輔酶 A在相應(yīng)的酶催化下聚合而成，該過程消耗NADPH，而PHB合酶作為該合成途徑中的最后一個(gè)酶而成為PHB合成的關(guān)鍵酶之一。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下細(xì)胞中雖有一定的PHB合成，但當(dāng)細(xì)胞處于正常生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)，PHB不發(fā)揮作用，故推測(cè)集胞藻中此途徑的敲除對(duì)細(xì)胞影響不大。

圖1 集胞藻PHB合成途徑示意圖[13]Fig. 1 PHB synthesis pathway in Synechocystis[13].

對(duì)于用于生產(chǎn)化學(xué)品的集胞藻而言，PHB的合成消耗了目標(biāo)化學(xué)品合成所需的還原力 NADPH及碳源，不利于進(jìn)行目標(biāo)化學(xué)品的生產(chǎn)。因此，阻斷集胞藻中PHB合成途徑，一方面可減少碳源在PHB合成上的消耗；另一方面，可使PHB合成中所需消耗的NADPH得以積累，提高了胞內(nèi)NADPH的含量，從而利于工程集胞藻合成目標(biāo)化學(xué)品。

本研究通過同源重組方法，用氯霉素抗性基因取代集胞藻6803 (Synechocystis sp. PCC 6803) 基因組中PHB合酶編碼基因phaC和phaE，獲得PHB合成途徑被成功阻斷并伴有細(xì)胞內(nèi) NADPH含量提高的集胞藻突變體S.ΔphaC&E，為進(jìn)一步開發(fā)集胞藻生產(chǎn)化學(xué)品，提高目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli DH5α、質(zhì)粒pUC18、質(zhì)粒pRL271、集胞藻6803均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

PrimeSTAR HS DNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶、去磷酸化酶CIP、T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB (北京) 有限公司；質(zhì)粒 DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、細(xì)菌RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司；抗生素購(gòu)自Amresco公司；其他常規(guī)試劑采用進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；引物合成和測(cè)序由上海英駿生物工程有限公司完成。

1.3 基因敲除載體pUC-HR的構(gòu)建

載體pUC-HR示意圖見圖2。通過PCR分別從集胞藻6803基因組中克隆到PHB合酶基因phaC和phaE上、下游各600 bp片段，分別命名為up、down。用融合 PCR方法將 down片段與來自質(zhì)粒pRL271的氯霉素抗性基因 catP相融合[15]，獲得融合片段 down-Cm，并將其插入到質(zhì)粒 pUC18的XbaⅠ位點(diǎn)，得到中間載體pUC-Cmdown。將up片段插入到中間載體pUC-Cmdown的SacⅠ和BamHⅠ位點(diǎn)，構(gòu)建帶有up-Cm-down結(jié)構(gòu)的用于PHB合酶基因敲除載體 pUC-HR。所用引物序列如需要可向作者索要。

圖2 基因敲除載體pUC-HRFig. 2 Diagram of gene knockout vector pUC-HR.

1.4 藍(lán)藻的轉(zhuǎn)化、篩選及鑒定

集胞藻6803置于光照培養(yǎng)箱 (GXZ-280c，寧波江南儀器廠) 中振蕩培養(yǎng)，溫度為30 ℃，光強(qiáng)為100 μm/(m2·s)，振蕩頻率為 130 r/min，培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基[15]。利用自然轉(zhuǎn)化方法并參照文獻(xiàn)中[17]關(guān)于提高轉(zhuǎn)化效率的優(yōu)化條件，用構(gòu)建好的載體pUC-HR轉(zhuǎn)化集胞藻6803，用10 mg/L氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子。分別提取野生藻、轉(zhuǎn)化子的基因組DNA作為模板，用up片段5′引物和down片段的3′端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定基因組完全分離的突變體S.ΔphaC&E。1%瓊脂糖電泳后使用凝膠成像儀(EC3，UVP) 檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 RNA提取及RT-PCR

用RNA提取試劑盒 (天根生化科技有限公司，北京) 提取野生藻 S.wt和突變體 S.ΔphaC&E的總RNA。用不含 RNA酶的 DNA酶處理提取的總RNA，以去除殘留的DNA。用Quant反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，為檢測(cè)可能殘留的DNA污染，用Taq聚合酶代替反轉(zhuǎn)錄酶為對(duì)照。按擴(kuò)增基因靠近 3′末端400~500 bp的原則設(shè)計(jì)引物，對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]。之后用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.6 藍(lán)藻生長(zhǎng)的測(cè)定

按比例分別接種野生藻 S.wt和基因敲除藻S.ΔphaC&E，確保兩種藻細(xì)胞的起始OD730一致，均為 0.2。吸光度測(cè)量使用 UNICO型號(hào)為 7200 spectrophotometer的紫外-可見分光光度計(jì)。光照振蕩培養(yǎng)，每隔24小時(shí)取藻液測(cè)定OD730，并以此做出生長(zhǎng)曲線，比較野生藻 S.wt、基因敲除藻S.ΔphaC&E之間生長(zhǎng)差異。

1.7 胞內(nèi)PHB含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)用氣相色譜測(cè)定胞內(nèi)PHB含量[14,16]。所用氣相色為島津公司的 GC2010氣相色譜儀，色譜柱為DB-5毛細(xì)管柱，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑320 μm。柱溫170 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃，載氣N20.14 MPa，使用氫焰檢測(cè)。

取80 mg左右干細(xì)胞于酯化管中，加入2 mL酯化液 (含有2 g/L苯甲酸、3% (V/V) 濃硫酸的甲醇溶液) 和2 mL氯仿，加蓋密閉，100 ℃酯化反應(yīng)4 h。冷卻至室溫后，加入1 mL去離子水，充分振蕩混勻，靜置分層。待氯仿相與水相完全分離后，取氯仿相進(jìn)行氣相色譜分析。使用內(nèi)標(biāo)法定量分析胞內(nèi)的PHB含量。

1.8 胞內(nèi)NADPH含量測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)方法[17-18]，使用酶標(biāo)儀 (SpectrsMax 190，Molecular Devices) 測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的NADPH含量。分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生藻及突變體30 mL (OD730≈0.8)，離心收集細(xì)胞。加入 1 mL 0.3 mol/L高氯酸，1 mmol/L EDTA，充分振蕩30 s，裂解細(xì)胞。離心棄細(xì)胞碎片，取上清。取0.5 mL上清，加入0.1 mL 2 mol/L K2CO3中和反應(yīng)。取上清，檢測(cè)細(xì)胞液在340 nm的吸光度。根據(jù)NADPH濃度與OD340關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定胞內(nèi)NADPH的濃度。

2 結(jié)果

2.1 藍(lán)藻基因敲除載體pUC-HR的構(gòu)建

經(jīng)DNA測(cè)序分析可知，從集胞藻6803基因組中克隆的PHB合成酶基因phaC上游600 bp片段up和 phaE下游 600 bp片段 down，及從質(zhì)粒pRL271[15]克隆的氯霉素抗性基因catP (1 050 bp)，序列均正確。

如載體酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜所示 (圖3)，用XbaⅠ進(jìn)行酶切，載體被切成3.3 kb和1.6 kb片段；用BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行酶切，分別切出約4.3 kb和0.6 kb片段，兩組酶切結(jié)果均與預(yù)期得到的片段大小相符。同時(shí)對(duì)基因敲除載體pUC-HR中的 up-Cm-down片段進(jìn)行 DNA測(cè)序分析，證明pUC-HR中的up-Cm-down的方向及序列正確。因此表明集胞藻 6803基因 phaC和 phaE敲除載體pUC-HR構(gòu)建成功。

圖3 敲除載體pUC-HR酶切產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜Fig. 3 Identification of plasmid pUC-HR by restriction enzyme digestion. 1: pUC-HR digested with Xba I; 2: pUC-HR digested with Sac I and BamH I; M: DNA marker III.

2.2 敲除 phaC和 phaE的集胞藻 6803突變體S.ΔphaC&E的獲得

為敲除集胞藻6803基因組中的PHB合酶編碼基因 phaC和 phaE，用構(gòu)建的基因敲除載體pUC-HR轉(zhuǎn)化集胞藻6803。經(jīng)過反復(fù)抗生素篩選，用基因 phaC上游片段 up5′端和 phaE下游 down3′端引物分別對(duì)轉(zhuǎn)化子和野生型藍(lán)藻基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖4所示，以野生藻為模板則擴(kuò)增得到3.4 kb片段，而以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板擴(kuò)增得到大小在2.26 kb片段，與預(yù)期的大小相符，證明集胞藻6803基因組中phaC和phaE基因 (約2.2 kb) 完全被氯霉素抗性基因catP (約1 kb) 取代，已成功得到基因組完全分離的基因敲除突變體S.ΔphaC&E。

圖4 集胞藻完全分離基因敲除突變體 S.ΔphaC&E的PCR驗(yàn)證Fig. 4 Identification of complete segregation Synechocystis mutant S.ΔphaC&E by PCR. 1: S.wt; 2: S.ΔphaC; M: DNA marker III.

為進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄水平證明phaC和phaE失活，對(duì)突變體及野生型進(jìn)行了RT-PCR比較分析。如圖5所示，以野生藻S.wt cDNA為模板檢測(cè)不到氯霉素抗性基因片段，但以基因敲除藻 S.ΔphaC&E的cDNA為模板，可檢測(cè)到氯霉素抗性基因片段。同時(shí)，以野生藻S.wt的cDNA為模板可檢測(cè)到PHB合酶基因片段，但以基因敲除藻S.ΔphaC的cDNA為模板，則檢測(cè)不到PHB合酶片段。因此，RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步證明，藍(lán)藻突變體 S.ΔphaC&E中 PHB合酶編碼基因已經(jīng)被氯霉素抗性基因取代。

圖5 RT-PCR鑒定基因敲除集胞藻突變體S.ΔphaC&EFig. 5 Identification of the transcription of chloromycetin resistance gene and PHB synthase gene in Synechocystis mutant S.ΔphaC&E by RT-PCR. 1: transcription of catP in S.wt; 2: transcription of chloromycetin resistance gene in S.ΔphaC&E; M: DNA marker I; 3: transcription of PHB synthase gene in S.ΔphaC&E; 4: transcription of PHB synthase gene in S.wt.

2.3 藍(lán)藻生長(zhǎng)的測(cè)定

成功構(gòu)建藍(lán)藻突變體S.ΔphaC&E后，對(duì)野生型及突變體的生長(zhǎng)進(jìn)行了比較研究。從生長(zhǎng)曲線 (圖6) 可以看出，PHB 合酶基因敲除藍(lán)藻突變體S.ΔphaC&E的生長(zhǎng)雖然略低于野生藻S.wt，但差異不大。這說明PHB合酶編碼基因的敲除基本不影響藍(lán)藻的生長(zhǎng)。

2.4 集胞藻胞內(nèi)PHB含量檢測(cè)

圖6 野生集胞藻S.wt和集胞藻突變體S.ΔphaC&E的生長(zhǎng)曲線Fig. 6 Growth curves of S.wt and Synechocystis mutant S.ΔphaC&E.

為檢測(cè)敲除phaC和phaE能否阻斷藍(lán)藻PHB的合成，對(duì)野生藻和突變體的胞內(nèi)PHB含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生藻S.wt中PHB積累約為細(xì)胞干重的 2.3% (2.30±0.12)，而基因敲除突變體S.ΔphaC&E中沒有 PHB的積累 (0.00±0.05)，說明phaC和phaE的敲除能夠阻斷藍(lán)藻中PHB的合成。

2.5 胞內(nèi)NADPH含量檢測(cè)

由于PHB的合成是消耗NADPH，因此對(duì)突變體和野生型胞內(nèi) NADPH含量進(jìn)行了比較分析。根據(jù)文獻(xiàn)[17-18]中的NADPH檢測(cè)方法，對(duì)野生藻S.wt和突變體S.ΔphaC&E中的NADPH進(jìn)行測(cè)定，得到NADPH濃度與OD340對(duì)應(yīng)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式為：y=10.333x?0.111，R2=0.998。其中，x為 OD340；y為 NADPH濃度 (nmol/L)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到NADPH含量隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線，如圖7所示，突變體S.ΔphaC&E胞內(nèi)的NADPH含量明顯提高，為野生藻 S.wt NADPH含量的 2.85倍。說明集胞藻6803細(xì)胞中 PHB合成途徑的阻斷，可以使胞內(nèi)NADPH含量提高。

圖7 野生集胞藻S.wt和集胞藻突變體S.ΔphaC&E胞內(nèi)NADPH的檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Detection of celluar NADPH contents of S.wt and Synechocystis mutant S.ΔphaC&E.

3 討論

利用代謝工程技術(shù)敲除生物代謝途徑中的關(guān)鍵基因，并結(jié)合輔因子工程技術(shù)，改變代謝流分布，構(gòu)建新的代謝途徑，在微生物代謝工程中具有重要作用[6]。

本研究結(jié)合代謝工程和輔因子工程的方法，以藍(lán)藻PHB合成途徑為改造對(duì)象，通過敲除PHB合酶基因成功阻斷集胞藻6803中PHB的合成，獲得胞內(nèi)還原力 NADPH含量明顯提高的工程藍(lán)藻S.ΔphaC&E。由于集胞藻6803的基因組是多拷貝的，因此我們通過對(duì)轉(zhuǎn)化子的反復(fù)多輪篩選，得到基因組完全分離的藍(lán)藻基因敲除突變體S.ΔphaC&E。在正常培養(yǎng)條件下集胞藻6803細(xì)胞內(nèi)是有PHB積累的。Hein’s等通過在大腸桿菌中表達(dá)集胞藻 6803 PHB合酶基因phaC和phaE，使大腸桿菌中可以產(chǎn)生PHB來證明PHB合酶是藍(lán)藻PHB合成的關(guān)鍵酶[19]。而本工作通過在藍(lán)藻中敲除PHB合酶基因阻斷PHB合成，更直接證明PHB合酶是集胞藻6803 PHB成途徑的關(guān)鍵酶。在本研究正常培養(yǎng)條件下，野生藻S.wt可以積累細(xì)胞干重2.3%的PHB作為碳源和能量?jī)?chǔ)備，這與前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[12]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)阻斷PHB合成對(duì)藍(lán)藻的生長(zhǎng)影響很小。推測(cè)原因應(yīng)與 PHB的生理功能有關(guān)。根據(jù)已報(bào)道的研究結(jié)果[19]，PHB作為細(xì)胞內(nèi)的碳源和能源儲(chǔ)備物質(zhì)，有利于細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境，增強(qiáng)生存能力。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下雖有一定的PHB合成，但當(dāng)細(xì)胞處于正常生長(zhǎng)環(huán)境時(shí)PHB不發(fā)揮作用，同時(shí)PHB的合成途徑與藍(lán)藻生長(zhǎng)的途徑無關(guān)聯(lián)，所以它的敲除對(duì)正常環(huán)境下生長(zhǎng)的細(xì)胞影響不大。因此，敲除PHB合成酶編碼基因阻斷PHB合成，可以實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻中碳流的重新分配，即把原本用于合成PHB的碳源用于目標(biāo)化學(xué)品的合成，使細(xì)胞內(nèi)有限的碳源得到更有效地利用，從而提高藍(lán)藻目標(biāo)化學(xué)品的產(chǎn)量。

PHB合成途徑需要有還原力NADPH的參與[13]，而本研究通過阻斷PHB合成得到胞內(nèi)NADPH含量增加的工程藍(lán)藻也進(jìn)一步證明了這一點(diǎn)。還原力NADPH/NADH是參與微生物代謝的重要輔助因子，而微生物細(xì)胞內(nèi)具有實(shí)現(xiàn)NADPH與NADH相互轉(zhuǎn)化的能力。近期McNeely等[20]的研究結(jié)果表明，增加藍(lán)藻胞內(nèi)還原力水平，可以提高藍(lán)藻相應(yīng)代謝產(chǎn)物水平，如乙酸，琥珀酸等。因此，本研究實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)NADPH含量提高，這將為藍(lán)藻合成還原型化合物提供充足的還原力，為進(jìn)一步提高藍(lán)藻化學(xué)品產(chǎn)量，開發(fā)藍(lán)藻產(chǎn)醇類、脂類等化學(xué)品奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究通過敲除PHB合成酶編碼基因phaC和 phaE成功阻斷了集胞藻6803中的PHB合成，實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)還原力 NADPH的有效積累，并且與野生藻相比，突變體藍(lán)藻S.ΔphaC&E的生長(zhǎng)沒有受到影響。本實(shí)驗(yàn)一方面由于成功阻斷PHB的合成，可以實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻中碳流的重新分配，為提高目標(biāo)化學(xué)品產(chǎn)量作了碳源重新分配上的準(zhǔn)備；另一方面提高了藍(lán)藻胞內(nèi) NADPH水平，為實(shí)現(xiàn)藍(lán)藻產(chǎn)化學(xué)品、提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提供了充足的還原力。因此，本研究所建立的成功阻斷 PHB合成途徑同時(shí)實(shí)現(xiàn)NADPH提高的藍(lán)藻突變體 S.ΔphaC&E，為藍(lán)藻產(chǎn)目標(biāo)化學(xué)品作了碳源和還原力方面的準(zhǔn)備，為藍(lán)藻產(chǎn)醇類、脂類等還原型化學(xué)品、提高化學(xué)品產(chǎn)量提供了理想菌株。

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