丹龍定喘湯對(duì)哮喘豚鼠氣道重塑的作用及機(jī)制研究

牟德英, 劉小凡

支氣管哮喘是一種以氣道炎癥和氣道重塑為顯著特征的慢性疾病[1,2]。氣道重塑可致哮喘反復(fù)發(fā)作,是難治性哮喘的重要病理基礎(chǔ)。預(yù)防和逆轉(zhuǎn)氣道重塑被認(rèn)為是治療支氣管哮喘,尤其是頑固性哮喘的有效途徑。劉小凡教授根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)理論結(jié)合多年臨床實(shí)踐,提出以運(yùn)脾補(bǔ)腎、活血祛痰法治療哮喘氣道重塑的觀點(diǎn),并以此立法,組方丹龍定喘湯應(yīng)用于臨床,療效顯著。本實(shí)驗(yàn)旨在探討丹龍定喘湯(運(yùn)脾補(bǔ)腎活血祛痰法)對(duì)哮喘豚鼠氣道重塑的干預(yù)作用,并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制,為拓展本法在哮喘治療中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性豚鼠24只,6～8周齡,體質(zhì)量200～300 g,由成都中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SCXK(川)2008-11)提供。將豚鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組、丹龍定喘湯組,每組6只。

1.2 主要藥品及試劑 丹龍定喘湯(由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供,每毫升相當(dāng)于生藥1 g),地塞米松針劑(河北天成藥業(yè)有限公司),卵蛋白(美國Sigma公司),氫氧化鋁干粉(成都科龍化工試劑廠),轉(zhuǎn)化生長因子β1(transform ing grow th factor β1,TGF-β1)試劑盒、SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 哮喘氣道重塑模型制備 依據(jù)文獻(xiàn)[3,4]造模。模型對(duì)照組、地塞米松組和丹龍定喘湯組豚鼠于第1天腹腔注射抗原混懸液1m L(含生理鹽水加卵蛋白100m g,氫氧化鋁干粉100 mg)致敏。14 d后,用1%卵清蛋白氣霧激發(fā),用霧化器噴入1%卵蛋白生理鹽水20 s,在霧室中自然吸入30 s,以豚鼠腹肌收縮為陽性,每日誘喘1次,共4周。空白對(duì)照組給予等量的生理鹽水于相同部位注射和霧化吸入。

1.4 給藥方法 各組均普通喂養(yǎng)。第15天起于每日激發(fā)前1 h灌胃給藥,12.5 m L/kg。模型對(duì)照組和空白對(duì)照組在第15～45天給予等容積生理鹽水灌胃,每日1次;地塞米松組第15～45天給予0.02%地塞米松霧化20min;丹龍定喘湯組第15～45天給予藥液灌胃。

1.5 取材及染色 各組豚鼠分別于末次給藥24 h內(nèi)稱重,麻醉后斷頭處死,迅速打開胸腔,取豚鼠整個(gè)肺臟,稱重記錄后,留取右肺中葉組織,置于10%甲醛加95%乙醇等量混合液中固定,備用于病理檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般狀況觀察 記錄豚鼠的進(jìn)食、體質(zhì)量、行為活動(dòng)等。

1.6.2 肺組織病理學(xué)觀察 右肺中葉組織固定24 h后,常規(guī)石蠟包埋,切成7μm厚切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織病理學(xué)特征。

1.6.3 肺總管支氣管壁面積(WA t)及管腔內(nèi)周長(Pi)的測(cè)定 HE染色后采用圖像分析儀系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。每只動(dòng)物選取3個(gè)完整支氣管截面在100倍光鏡下用圖像分析軟件測(cè)量,取面積、周長、積分光密度3個(gè)參數(shù),設(shè)定最小目標(biāo)面積(實(shí)際值:5,像素值:5),結(jié)果取平均值。根據(jù)James等[5]的觀點(diǎn),氣道在收縮和舒張不同狀態(tài)下,其內(nèi)周長保持不變,故用Pi將WA t值標(biāo)準(zhǔn)化,以WA t/Pi表示支氣管管壁的厚度,反映氣道重塑的程度。

1.6.4 肺支氣管壁平滑肌面積(WAm)的測(cè)定 采用Masson三原色染色法,操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行,由病理科專人操作。在多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)下,采用連接計(jì)算機(jī)的顯微鏡(100倍),選取3個(gè)完整的支氣管截面,取面積、周長、平均光密度、積分光密度、平均黑度5個(gè)參數(shù),設(shè)定最小目標(biāo)面積(實(shí)際值:5,像素值:5),測(cè)量WAm及Pi,結(jié)果取其平均值,用Pi將WAm標(biāo)準(zhǔn)化,以 WAm/Pi表示支氣管平滑肌的厚度,反映氣道重塑的程度。

1.6.5 TGF-β1含量的測(cè)量 采用SP法免疫組織化學(xué)染色法,操作嚴(yán)格按SP試劑盒說明書進(jìn)行,由病理科專人操作。在多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)下,采用連接計(jì)算機(jī)的顯微鏡測(cè)量。以細(xì)胞質(zhì)清晰棕黃色為陽性,采用圖像分析軟件對(duì) TGF-β1陽性部位進(jìn)行原位定量檢測(cè),每張切片選用3個(gè)視野(×200),自動(dòng)選取陽性部位并計(jì)算相對(duì)積分光密度值(integral optical density,IOD)值。取面積、周長、平均光密度、積分光密度、平均黑度5個(gè)參數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,數(shù)據(jù)用 x±s表示,用單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Tamhane法(方差不齊)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般表現(xiàn) 空白對(duì)照組:進(jìn)食量隨體質(zhì)量增加而逐漸增加,活動(dòng)量正常,體毛順滑有光澤,灌生理鹽水后無明顯不適;模型對(duì)照組:經(jīng)抗原激發(fā)后,出現(xiàn)精神萎靡,行動(dòng)遲緩、毛發(fā)失去光澤,呼吸急促,腹肌收縮,活動(dòng)后氣喘加重;地塞米松組和丹龍定喘湯組:激發(fā)后活動(dòng)量減少,呼吸急促,活動(dòng)后加劇,毛色有光澤,飲食如常。

2.2 肺組織病理改變 空白對(duì)照組無氣道壁增厚,氣道黏膜結(jié)構(gòu)完整,無明顯炎癥反應(yīng);模型對(duì)照組豚鼠氣道壁明顯增厚且不完整,氣道平滑肌層和網(wǎng)狀基底膜層增厚,氣道黏膜皺襞增多,氣道周圍明顯的炎細(xì)胞浸潤,以嗜酸性粒細(xì)胞為主;丹龍定喘湯組和地塞米松組豚鼠氣道壁增厚不明顯,氣道黏膜結(jié)構(gòu)較完整,炎癥反應(yīng)輕微。

2.3 氣道形態(tài)學(xué)指標(biāo)及豚鼠支氣管管壁 TGF-β1 IOD值比較 見表1。

表1 各組氣道形態(tài)學(xué)指標(biāo)及豚鼠支氣管管壁TGF-β1 IOD 值比較( x±s,n=6,μm)

表1結(jié)果說明,模型對(duì)照組 WA t/Pi、WAm/Pi均顯著增加,豚鼠肺組織中的 TGF-β1含量增加,與空白對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明模型對(duì)照組豚鼠肺支氣管管壁和平滑肌明顯增厚,TGF-β1含量明顯增加。丹龍定喘湯組氣道壁厚度減輕,TGF-β1含量減少,與模型對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與地塞米松組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

支氣管哮喘是當(dāng)今世界威脅公共健康最常見的慢性疾病之一。全球約有哮喘患者2億[6],近20年內(nèi)哮喘病的患病率在世界范圍內(nèi)顯著增加,并且有繼續(xù)增加的趨勢(shì)[7]。因此,哮喘已成為一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題而引起了世界衛(wèi)生組織、各國政府及臨床醫(yī)師的廣泛關(guān)注,對(duì)哮喘的研究也越來越深入。盡管如此,哮喘的治療仍是一個(gè)尚未解決的醫(yī)學(xué)難題。

氣道重塑是哮喘患者特征性的病理改變[1,2],可導(dǎo)致哮喘反復(fù)發(fā)作,氣道高反應(yīng)性進(jìn)行性加重,肺功能持續(xù)下降,氣道不可逆阻塞最終形成,是難治性哮喘的重要病理基礎(chǔ)。預(yù)防和逆轉(zhuǎn)氣道重塑被認(rèn)為是治療支氣管哮喘,尤其是頑固性哮喘的有效途徑。

對(duì)于氣道重塑的治療,西醫(yī)尚無確切有效的藥物。目前認(rèn)為治療哮喘最有效的藥物是糖皮質(zhì)激素,雖然能抑制炎癥反應(yīng)、減輕癥狀,但其能否有效防治氣道重塑還存在很大的爭議[8]。并且長期運(yùn)用激素產(chǎn)生的一系列問題也不容易忽視,如副反應(yīng)大、激素抵抗、激素依賴等,且吸入劑費(fèi)用昂貴。因此,積極尋求能有效控制氣道炎癥,抑制氣道重塑,降低氣道高反應(yīng)性,且毒副反應(yīng)小的綜合性治療藥物,是當(dāng)前面臨的一項(xiàng)重大課題。

支氣管哮喘屬于中醫(yī)“哮病”范疇,中醫(yī)治療哮喘有兩千多年的經(jīng)驗(yàn),中醫(yī)藥具有多途徑,多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì),運(yùn)用中醫(yī)藥探索抑制氣道重塑的方法,是哮喘治療的新的發(fā)展方向。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為,哮喘發(fā)作的主要病理因素是“痰”,故在哮喘治療中運(yùn)脾除濕以助消痰;瘀血是哮喘反復(fù)發(fā)作的主要病機(jī)之一,以活血化瘀法治療哮喘;同時(shí)腎為氣之根,哮喘遷延總不離于腎,強(qiáng)調(diào)在哮喘的整個(gè)病程中予以補(bǔ)腎藥物治療。丹龍定喘湯充分體現(xiàn)了上述治則,其主藥有丹參、地龍、當(dāng)歸、熟地、半夏、陳皮、茯苓等。方中丹參功擅活血祛瘀,作用平和,活血而不傷正,《本草便讀》謂其“為調(diào)理血分之首藥”;地龍功擅祛風(fēng)通絡(luò),丹參與地龍相配,起到活血化瘀,通絡(luò)平喘的作用。熟地寒潤滋腎,“為壯水之圣藥”,當(dāng)歸溫潤補(bǔ)血,為血中氣藥,當(dāng)歸與熟地相合,補(bǔ)肺益腎,金水相生,以固其本;當(dāng)歸與丹參相配,可增強(qiáng)活血化瘀的功效。二陳湯為治療濕痰之要方。諸藥相合,肺腎同治,痰瘀并調(diào),正氣得固,邪氣得除,喘咳自止。

目前認(rèn)為氣道重塑是指氣道在慢性炎癥反復(fù)不斷刺激下所發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)變化,包括氣道平滑肌細(xì)胞增生和肥大,細(xì)胞外基質(zhì)(膠原)沉積、基底膜增厚,炎癥細(xì)胞浸潤和腺體增生肥大,是哮喘氣道病理改變的重要基礎(chǔ)[9]。本實(shí)驗(yàn)顯示,光鏡下哮喘模型組氣道平滑肌明顯增厚,肺泡壁普遍增厚,氣道形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果也表明,哮喘豚鼠支氣管平滑肌層顯著增厚,整個(gè)支氣管壁顯著增厚,符合氣道重塑的病理學(xué)改變。而丹龍定喘湯的干預(yù)能顯著阻斷這種氣道壁增厚的趨勢(shì),提示運(yùn)脾補(bǔ)腎活血祛痰中藥能有效抑制哮喘豚鼠的氣道重塑。

TGF-β是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞生長因子家族,是具有強(qiáng)烈致纖維化的細(xì)胞因子,它誘導(dǎo)的凋亡反應(yīng)是引起肺纖維化的前提,近年的研究表明TGF-β在哮喘的發(fā)病過程中與上皮炎癥損傷后的修復(fù)過程及氣道重塑密切相關(guān)[10]。抑制TGF-β1的表達(dá)可能阻止或減輕哮喘的氣道重塑。研究發(fā)現(xiàn),哮喘患者支氣管黏膜活檢標(biāo)本中表達(dá)的TGF-β較正常人顯著增多,且TGF-β與基底膜和成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯相關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,哮喘模型組豚鼠肺組織中的 TGF-β1含量顯著增多,證實(shí)了 TGF-β1在哮喘氣道重塑中發(fā)揮重要作用,TGF-β1過度表達(dá)是導(dǎo)致氣道重塑的重要因素。而經(jīng)丹龍定喘湯治療后,哮喘豚鼠肺組織中TGF-β1含量顯著減少,提示運(yùn)脾補(bǔ)腎活血祛痰中藥作用于氣道重塑的可能機(jī)制是通過下調(diào)豚鼠肺組織中的TGF-β1的水平,抑制氣道平滑肌細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的增殖,從而阻止氣道重塑的進(jìn)程。

中醫(yī)藥在防治哮喘方面有著豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和確切的臨床療效,但其研究多數(shù)停留在臨床觀察與癥狀描述方面。本次研究探討了運(yùn)脾補(bǔ)腎活血祛痰中藥對(duì)哮喘模型氣道重塑的干預(yù)作用,并初步揭示其可能的作用機(jī)制,為運(yùn)脾補(bǔ)腎活血祛痰中藥在哮喘治療中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。并進(jìn)一步提示今后可繼續(xù)以氣道重塑為切入點(diǎn),發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì),在哮喘防治中走出中國獨(dú)特的道路。

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