松江鱸Myostatin基因內(nèi)含子和線粒體D-loop DNA序列分析

邵 芳，費(fèi)曉燕，盧祥云，徐建榮，顧志良

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

松江鱸（Trachidermus fasciatus）屬鲉形目，杜父魚科，松江鱸屬.近年來由于資源枯竭，種群瀕危，已被列為國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物.目前對(duì)松江鱸的研究主要集中在生態(tài)、生理、胚胎發(fā)育與繁殖習(xí)性等方面[1].為有效保護(hù)和合理利用松江鱸資源，對(duì)其種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的研究就顯得尤為重要．

肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)作為骨骼肌生長發(fā)育的負(fù)調(diào)節(jié)因子[2]，引起生物學(xué)家的廣泛關(guān)注.弄清MSTN基因的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)闡明骨骼肌生長發(fā)育的調(diào)控機(jī)理具有重要意義.研究表明魚MSTN基因由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成[3-5]，我們對(duì)松江鱸MSTN基因的全長cDNA和組織表達(dá)特異性作了研究[6]，但目前對(duì)松江鱸MSTN基因的內(nèi)含子序列尚未有報(bào)道.mtDNA是獨(dú)立于細(xì)胞核基因組外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，在mtDNA上存在一個(gè)獨(dú)特的D-loop結(jié)構(gòu)，是整個(gè)線粒體基因組序列和長度變異最大的區(qū)域，其進(jìn)化速度最快.線粒體DNA的D-loop區(qū)可用于研究物種起源和進(jìn)化以及種內(nèi)種群的系統(tǒng)進(jìn)化分析，探討物種在進(jìn)化過程中可能發(fā)生的變異情況.魚類mtDNA是一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的復(fù)制單位，具有分子小、結(jié)構(gòu)簡單、重組率低、進(jìn)化速度快、不同區(qū)域進(jìn)化速度有差異等特點(diǎn)，是魚類進(jìn)化遺傳學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、遺傳多樣性及其保護(hù)生物學(xué)等研究的重要標(biāo)記[7]．

本研究對(duì)MSTN基因內(nèi)含子1、2以及長江、丹東和葫蘆島的松江鱸線粒體D-loop區(qū)擴(kuò)增和測序，檢測不同地理群體松江鱸線粒體D-loop區(qū)的多態(tài)性，探索種群內(nèi)和種群間的遺傳多樣性狀況，為今后松江鱸的資源保護(hù)、開發(fā)和養(yǎng)殖提供相應(yīng)的理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料：

本實(shí)驗(yàn)所用的松江鱸來自長江（C）、丹東（D）、葫蘆島（H）三個(gè)地理群體.實(shí)驗(yàn)所用材料由蘇州市長江特色水產(chǎn)繁殖工程中心提供.將魚宰殺后取肌肉組織在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫梅?氯仿法提取基因組DNA．

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)我們克隆的松江鱸Myostatin基因cDNA序列（Genbank登錄號(hào)：GU198192)，以及斑馬魚和鯉魚Myostatin基因DNA序列（Genbank登錄號(hào)：AY693972，GQ214770），分別設(shè)計(jì)引物Sjl intr1 F1/R1，Sjl intr2 F1/R1以擴(kuò)增松江鱸Myostatin基因的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2序列.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布松江鱸線粒體D-loop部分序列（Genbank登錄號(hào)：AB188172），設(shè)計(jì)引物SjldpF1/R1，擴(kuò)增松江鱸D-Loop部分片段，以分析不同地理群體的關(guān)系.引物由上海生工生物工程有限公司合成．

表1 實(shí)驗(yàn)所用的引物序列

1.3 松江鱸Myostatin基因內(nèi)含子的PCR擴(kuò)增和克隆

PCR擴(kuò)增在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行：0.2μL ExTaq酶（5U·μL-1，TaKaRa Tokyo，Japan），2.5μL10×PCR ExTaq Buffer（with Mg2+），2μL dNTP（2.5mmol·L-1each），Sjl intr1 F1和Sjl intr1 R1各1μL（10μM），基因組DNA（100ng/μL）1μL，加滅菌水至25μL.PCR擴(kuò)增條件為95℃變性3min；然后在95℃ 30 Sec，60℃30Sec，72℃1.5min，進(jìn)行30次循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存.將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段.將回收片段克隆到PCR2.1 Vector（Invitrogen，美國）中，挑取陽性菌落，于LB液體培養(yǎng)基（Amp+）中搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后將重組質(zhì)粒送往上海桑尼生物科技公司進(jìn)行測序．

1.4 不同地理群體線粒體D-loop序列擴(kuò)增和序列測定

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上述1.3.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化目的片段，直接測序．

1.5 數(shù)據(jù)分析

將獲得的序列在DNAMAN5.0軟件上進(jìn)行分析，并進(jìn)行物種間同源性比較.利用MEGA4.1軟件中的Kimura 2-parameter法計(jì)算凈遺傳距離矩陣，以距離矩陣鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）建系統(tǒng)發(fā)生樹，通過自引導(dǎo)檢驗(yàn)（bootstrap）獲得系統(tǒng)分支的置信度（重復(fù)次數(shù)為1000）．

2 結(jié)果與分析

2.1 松江鱸MSTN基因內(nèi)含子的擴(kuò)增

以松江鱸基因組DNA為模板，用引物Sjl intr1F1/R1和Sjl intr2F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測（圖1）.電泳檢測結(jié)果顯示，分別得到了450bp和1000bpPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與設(shè)計(jì)的目的片段長度相同.將這兩個(gè)片段分別回收后克隆到PCR2.1載體中，經(jīng)測序后獲得了兩個(gè)片段的核苷酸序列，與松江鱸的MSTN基因cDNA序列比對(duì)，確認(rèn)該序列為松江鱸MSTN基因的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2序列．

圖1 松江鱸MSTN基因內(nèi)含子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 松江鱸MSTN基因內(nèi)含子的序列分析

通過PCR擴(kuò)增并克隆測序后獲得了松江鱸MSTN基因內(nèi)含子1和內(nèi)含子2的序列，內(nèi)含子1長度為325bp，內(nèi)含子2長度為835bp（圖2和3），兩個(gè)內(nèi)含子的兩端都符合GT-AG規(guī)則.在內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)（AC）14的微衛(wèi)星序列．

圖2 松江鱸MSTN基因的內(nèi)含子1序列

圖3 松江鱸MSTN基因的內(nèi)含子2序列

根據(jù)對(duì)其他物種MSTN基因序列的分析，發(fā)現(xiàn)魚類中存在幾種MSTN基因，包括MSTN1a，MSTN1b，MSTN2a，MSTN2b4種基因，且每個(gè)物種的MSTN基因都是含有兩個(gè)內(nèi)含子，三個(gè)外顯子，不同物種的內(nèi)含子長度不盡相同[6，8-10].表2為不同物種MSTN基因的內(nèi)含子長度，可以發(fā)現(xiàn)有的物種中內(nèi)含子1比內(nèi)含子2長，有的物種內(nèi)含子2比內(nèi)含子1長.斑點(diǎn)叉尾鮰的MSTN內(nèi)含子1最長為1748bp，瘤棘鲆MSTN內(nèi)含子1最短為244bp，斑馬魚MSTN-2的內(nèi)含子2最長為2201bp，尖吻鱸的MSTN內(nèi)含子2最短為188bp.而我們得到的松江鱸MSTN基因的內(nèi)含子2比內(nèi)含子1長．

2.3 不同地理群體松江鱸的線粒體D-loop序列比較

對(duì)分別來自長江、丹東、葫蘆島三個(gè)不同地理群體的松江鱸18個(gè)個(gè)體線粒體D-loop片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和測序.用DNAMAN軟件對(duì)這18個(gè)個(gè)體進(jìn)行序列比對(duì)后，共發(fā)現(xiàn)19個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，但是未發(fā)現(xiàn)具有地理群體特征的單倍型.將這18個(gè)個(gè)體用MEGA軟件繪制N-J進(jìn)化樹，也未發(fā)現(xiàn)三個(gè)地理群體松江鱸的特征性差異．

表2 不同物種MSTN基因內(nèi)含子的長度比較

3 討論

本研究根據(jù)松江鱸MSTN的cDNA序列設(shè)計(jì)引物，獲得了松江鱸MSTN基因的內(nèi)含子1和內(nèi)含子2序列，該序列符合真核基因內(nèi)含子的特征.在內(nèi)含子2中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)（AC）14的重復(fù)序列.研究表明，已在多種哺乳動(dòng)物的MSTN基因中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星序列，De la Rosa-Reyna（2006）在牛MSTN內(nèi)含子1中的T-motif中發(fā)現(xiàn)了（TG）微衛(wèi)星[11]；姜運(yùn)良（2004）在豬MSTN側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)（TG）13的微衛(wèi)星標(biāo)記[12].在魚類的MSTN基因中也發(fā)現(xiàn)了微衛(wèi)星序列：金鯛MSTN內(nèi)含子Ⅱ和3′-UTR區(qū)內(nèi)都存在(AC)n重復(fù)序列[4]，石鼓魚MSTN序列的3′-UTR區(qū)存在(AC)29微衛(wèi)星序列[13]；大黃魚肌肉生長抑制素基因的3′-UTR區(qū)存在（CA）n微衛(wèi)星序列，且該微衛(wèi)星座位與大黃魚體長和體重存在輕度的正相關(guān)[14]．

對(duì)物種進(jìn)化的分子生物學(xué)研究目前主要集中在線粒體DNA方面，多數(shù)主要依賴于線粒體D-loop的信息，我們檢測到了松江鱸不同個(gè)體間的D-Loop區(qū)序列存在差別，但是三個(gè)地理群體未發(fā)現(xiàn)明顯的地理序列特征.可能是由于這些地理群體分隔時(shí)間短，沒有明顯大的差別.這一結(jié)果在對(duì)松江鱸MSTN基因序列多態(tài)性的檢測時(shí)一定程度上得到了驗(yàn)證，在松江鱸MSTN基因的兩個(gè)內(nèi)含子和3′-UTR區(qū)未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)（未發(fā)表資料），三個(gè)地理群體之間沒有明顯差異，一方面說明了MSTN基因比較保守，另一方面，可能也是由于這幾個(gè)地理群體的松江鱸分隔時(shí)間短.我們將進(jìn)一步檢測其他線粒體基因中的變異情況，加入其他基因的信息，分析這些地理群體的松江鱸之間進(jìn)化的關(guān)系．

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