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    清氣化痰湯對急性肺損傷小鼠水通道蛋白1表達的影響*

    2011-02-08 07:59:10鄧青南周建龍郭振輝
    中國中醫(yī)急癥 2011年1期
    關鍵詞:清氣肺水腫空白對照

    鄧青南 周建龍 郭振輝

    廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院(廣東廣州510010)

    內毒素性急性肺損傷(ALI)臨床上表現(xiàn)為肺水腫及肺不張引起的呼吸急促,如果得不到及時有效的治療,最終將會形成急性呼吸窘迫綜合征,造成機體不可逆的急性呼吸功能衰竭?,F(xiàn)代醫(yī)學主要是采取大劑量激素沖擊療法配合細胞因子拮抗劑,中性粒細胞蛋白分解酶抑制劑,抗氧化劑等方法,療效欠佳。中藥治療內毒素性肺損傷有其獨特優(yōu)勢,目前主要為清熱解毒、活血化瘀等方法[1-2]。自第一個水通道蛋白AQP1被發(fā)現(xiàn)以來,有關AQP的分布及其維持細胞內外穩(wěn)態(tài)平衡中的作用日益受到重視。本實驗通過脂多糖(LPS)復制ALI模型,探討清氣化痰湯和AQP1的相關性及清氣化痰湯治療ALI的機制。

    1 材 料

    健康昆明種小鼠24只,雄性,體質量18~20g,由廣東省動物實驗中心提供。脂多糖(LPS,美國Sigma公司); AQP1、腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、白細胞介素 1β(IL-1β)引物由上海生工提供。RNA提取及逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)。清氣化痰湯組成:瓜蔞仁 18g,杏仁 18g,枳實 18g,陳皮 18g,黃芩 18g,茯苓18g,制半夏27g,膽南星27g(由廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供,自行煎制)。

    2 方 法

    2.1 ALI動物模型制備 將24只小鼠隨機平均分為空白對照組,模型對照組,清氣化痰湯組。給小鼠腹腔注射質量濃度為200μg/mL的 LPS(10mg/kg)建立 ALI模型,對照組予以等量的生理鹽水作為對照。在6h時間點處死小鼠,并立即解剖肺組織,左上肺進行濕重/干重比(w/d)檢測,左中下行石蠟包埋,并制成病理切片。右肺制成肺組織勻漿行PCR檢測。

    2.2 w/d的測定與肺組織病理觀察 稱取左上肺濕重 (w)后,置70℃恒溫箱,24h后稱干重(d),計算w/d。肺組織經過10%的甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,HE染色,光鏡下觀察ALI的病理變化。

    2.3 RT-PCR檢測肺組織AQP1、TNF-α、IL-1β的mRNA表達。引物序列分別為:AQP1上游引物:CTGGCCTTTGGTTTGAGCGT,AQP1下游引物:CCACACACTGGGCGATGAT,片段長度為149bp;TNF-α 上游引物:AGCCGATGGGTTGTA,TNF-α 下游引物:ACTTGGGCAGATTGA,片段長度為266bp;IL-1β上游引物:GCTTCAGGCAGGCAGTAT,IL-1β 下游引物:ACAAACCGCTTTT CCATCT, 片段長度為 475bp;β-actin上游引物:CTGTCCCTGTATGCCTCTG,IL-1β 下游引物:ATGTCACGCACGATTTCC,片段長度為 218bp;AQP1的 PCR擴增條件:94℃變性 55s,53.5℃退火 56s,72℃延伸 55s,循環(huán) 35 次,72℃擴增 5min,TNF-α 的退火溫度為53.5℃,其余條件相同。IL-1β的退火溫度為53.5℃,其余條件相同。β-actin的退火溫度為53.5℃,其余條件相同。長波紫外燈下觀察并照相,Bio Rad成像系統(tǒng)分析電泳條帶,Quantity One圖像分析軟件計算 AQP1、TNF-α、IL-1β 的 mRNA與 βactin mRNA比值。

    2.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以表示,組間差異的比較采用one-way ANOVA方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    3 結 果

    3.1 肺大體觀察 空白對照組、清氣化痰湯組肺外觀均無明顯異常改變。模型對照組肺體積增大,暗紅色,散在有大小不一紅色斑點,切片疏松,有淡紅色液體滲出。

    3.2 肺病理觀察 空白對照組、清氣化痰湯組光鏡下示肺泡結構清晰完整,無明顯異常。模型對照組光鏡下肺泡壁充血增厚,肺泡間隔增寬,腔內有少許出血、滲出及炎性細胞浸潤,肺間質充血水腫,有大量炎性細胞浸潤(見圖1)。

    圖1 各組肺病理組織圖(HE染色)

    3.3 肺w/d 模型對照組的肺w/d值較空白對照組顯著升高(P<0.01),清氣化痰湯組較模型對照組均明顯改善(P<0.05)(見表 1)。

    3.4 AQP1mRNA、TNF-αmRNA和 IL-1βm RNA的表達 RTPCR檢測結果顯示:模型對照組大鼠肺組織AQP1 mRNA的表達較空白對照組明顯降低 (P<0.01),清氣化痰湯組肺組織AQP1 mRNA的表達較模型對照組明顯回升(P<0.05)。模型對照組大鼠肺組織TNF-αmRNA的表達較對照組明顯升高 (P<0.05),清氣化痰湯組肺組織TNF-αmRNA的表達較模型對照組明顯降低(P<0.05)(見表 2,圖 2)。

    表1 各組w/d比值的比較

    表1 各組w/d比值的比較

    與模型對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。下同。

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    圖2 PCR電泳結果

    表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達比較

    表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達比較

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    4 討 論

    嚴重感染是最常見的原因,其中內毒素性ALI是臨床上常見的危重病癥,許多疾病都容易并發(fā)內毒素性ALI。其病理特征主要是肺組織水腫及肺不張,細胞上表現(xiàn)為多種炎性因子和炎癥介質的過度釋放,促炎抗炎反應失衡。近年研究表明,肺臟的液體平衡遭到破壞,通透性增高導致產生肺水腫與水通道蛋白密切相關。中醫(yī)學認為感染、炎癥等多屬溫熱病范疇。肺為嬌臟,為五臟之華蓋,病邪入侵,常先傷肺,邪毒壅肺,肺失宣降,氣不布津,又致病理產物內聚,機體炎癥反應加重,病變由肺而累及全身,這與現(xiàn)代醫(yī)學對于發(fā)生發(fā)展過程的認識甚為相似。中藥或復方常常是多成分、多靶點、多途徑、多機制發(fā)揮作用,對于綜合調控復雜的炎癥反應更具優(yōu)勢[3]。

    AQPs是對水有特異性轉運功能的細胞膜通道蛋白,人類和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有10個亞型,分布在肺、腎、眼部。其中已知在肺組織和氣道至少有 4 種 AQPs (AQP1、AQP3、AQP4、AQP5)表達并參與肺液體轉運,其中,與肺損傷關系最密切的研究主要以AQP5和AQP1為主。

    AQP1主要在氣道周圍毛細血管、淋巴管及肺泡毛細血管內皮細胞和臟層胸膜間皮細胞上表達,主要負責清除支氣管和脈管周圍組織的內水分[4]。AQP5主要表達在肺泡Ⅰ型上皮細胞及氣道分泌上皮頂質膜,作用主要是清除肺泡腔內水分[5]。AQP1、AQP5特異性地轉運水分子,其他溶質和分子則不能通過,有效維持血管與間質之間水平衡[4]。與野生型小鼠相比,AQP1或AQP5基因敲除小鼠肺泡毛細血管間水的滲透性、通透性均降低約10倍。AQP1和AQP5均敲除小鼠肺泡毛細血管間水的滲透性、通透性降低約25~30倍左右[6-7]。AQPs在各種原因形成的肺損傷肺水腫中起重要作用。腺病毒感染小鼠毒造成病毒性肺炎,肺水明顯增加,在病毒感染后7d和14d分別檢測AQP1和AQP5,發(fā)現(xiàn)兩者表達量均有顯著降低,但在14天時AQP1的表達有所回升,同時與炎癥反應減輕相一致,提示AQPs的減少可能是肺水在肺間質聚集的重要原因,表明AQPs可能在病毒感染后的肺水腫中起主要作用[8]。譚利平[9]研究發(fā)現(xiàn),與空氣對照組相比,高氧暴露不同時間后,AQP5特異性表達部位保持不變,但隨暴露時間延長,AQP5表達呈逐漸減弱趨勢,推測高氧肺損傷時AQP5表達降低,可能是高氧肺損傷肺水腫形成的原因之一。ALI/ARDS病理過程中,AQP1、5表達下調,肺泡-毛細血管間水轉運障礙,導致液體在肺泡腔、肺間質的積聚,從而使肺泡腔、肺間質水腫加重,可能參與了肺水腫時液體的異常轉運。研究發(fā)現(xiàn)肺損傷后AQP1、5在調節(jié)肺內液體平衡中起一定作用,可能參與了肺水腫的發(fā)病機制[10]。高巨[11]首次觀察到失血性休克和內毒素刺激下大鼠肺組織AQP5的蛋白表達水平明顯下調,肺組織損傷嚴重,提示二次打擊后機體清除肺間質和肺泡腔過多水分的能力明顯減弱,肺泡-毛細血管膜水通透性顯著降低。與此相對應,二次打擊后該組的肺組織含水量也明顯增加。

    本實驗中,模型對照組大鼠w/d值較空白對照明顯增大,出現(xiàn)肺間質水腫同時AQP1表達明顯下調,經清氣化痰湯治療后,大鼠肺損傷肺水腫改善,同時AQP1表達上調。炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達與AQP1表達結果相反。實驗證明肺水腫吸收障礙可能有與AQP1表達下調有關。清氣化痰湯可通過增加肺毛細血管和淋巴管AQP1的表達,提高肺間質水腫液的跨內皮轉運,促使水從肺間質回流到血管系統(tǒng),進而促進肺水腫的吸收,可達到治療ALI的目的。本研究發(fā)現(xiàn)清氣化痰湯上調AQP1的表達,可能是通過下調TNF-α、IL-1β等表達實現(xiàn)的。

    [1] 韓恩昆,吳咸中.大承氣湯和活血清胰湯對重型急性胰腺炎肺損傷治療的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結合外科雜志,2004,10(2):90-92.

    [2] 張雪梅,陳海龍,王朝暉.清胰湯對大鼠急性胰腺炎肺損傷時-表達的影響[J].世界華人消化雜志,2007,15(35):3738-3743.

    [3] 劉建新,余林中.中藥保護急性肺損傷作用機理研究進展[J].陜西中醫(yī)學院學報,2009,11(6):83-85.

    [4] SongYL,YangBX,Michael AM,etal.Roleofayuaporin water channels in pleural fluid dynamics[J].Am JPhysioLCell Physiol,2000,279:1744-1750.

    [5] King LS,Agre P.Pathophysiology of theaquaporin water channels [J].Ann Rev Physiol,1997,58(5):619-648.

    [6] Song Y,Ma T,Matthav M A,et al.Role of aquaporin-4 in airspaceto-capillary water permeability in intact mouse lung measured by a novel gravimetric method[J].JGen Physiol,2000,115(1):17-27

    [7] Ma T,F(xiàn)ukuda N,Song Y,et al.Lung fluid transport in aquaporin-5 knockout mice[J].JClin Invest,2000,105(1):93-100.

    [8] Towne J E,Harrod K S,Krane C M,et al.Decreased expression of aquaporin(AQP)1 and AQP5 in mouselungafter acuteviral infection[J].Am JRespir Cell Mol Biol,2000,22(1):34.

    [9] 譚利平.水通道蛋白5在高氧肺損傷中的表達及調節(jié)機制[J].中國危重病急救醫(yī)學,2006,18(8):462-465.

    [10]謝艷萍.急性肺損傷大鼠肺水通道蛋白1和5的表達及功能的實驗研究[J].中華結核和呼吸雜志,2005,28(6):385-400.

    [11]高巨.“失血性休克-內毒素”二次打擊所致肺損傷水通道蛋白的表達[J].中國急救醫(yī)學,2007,27(6):546-548.

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