芪棱湯對腦缺血再灌注損傷大鼠VEGF、CD34的影響

周榮峰 鄧 茜 指導(dǎo) 蔣紅玉

1廣東省深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院（廣東深圳518108）

2暨南大學(xué)第二附屬醫(yī)院深圳市人民醫(yī)院（廣東深圳518020）

近期的動物實驗發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血后可誘導(dǎo)缺血半暗帶區(qū)的新生血管形成。這種腦血管生成是通過血管生長因子與內(nèi)皮細胞上表達的酪氨酸受體結(jié)合而調(diào)控的。但是這種血管形成數(shù)量有限，并不足以挽救血液灌注不足引起的損害［1］。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是作用于血管內(nèi)皮細胞的特異性多功能因子，參與腦缺血后腦組織的病理修復(fù)過程［2］。治療性血管新生方法的出現(xiàn)，為急性腦梗死的治療開辟了一條通向缺血性腦卒中再血管化的新途徑［3］。本研究旨在觀察芪棱湯對腦缺血再灌注后VEGF表達及微血管生成的影響，以進一步闡明芪棱湯抗大鼠腦缺血再灌注損傷的機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠126只，SPF級，體質(zhì)量（300±30）g，月齡4月左右。由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：2005A010。

1.2 藥品與試劑 芪棱湯精制液：主要藥物黃芪、桑椹、天花粉、三棱、莪術(shù)、枳殼、豨薟草、水蛭等，質(zhì)量濃度為每毫升含生藥1.5g。芪棱湯去養(yǎng)陰藥精制液：主要藥物為芪棱湯去桑椹、天花粉等，質(zhì)量濃度為每毫升含生藥0.85g。兩種精制液均由深圳市人民醫(yī)院制劑中心提供。VEGF兔多克隆抗體、CD34兔多克隆抗體、PowerVision二步法試劑盒及DAB顯色系統(tǒng)均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 分組與給藥 126只SD大鼠隨機分為芪棱湯組、芪棱湯去養(yǎng)陰藥組、模型組、假手術(shù)組（6只），前3組每組又進一步分為缺血3h再灌注 6h、12h、1d、3d、7d 5 個亞組，各亞組每組 8 只。 芪棱湯組灌服芪棱精制液、芪棱湯去養(yǎng)陰藥組給予芪棱湯去養(yǎng)陰藥精制液，其余兩組予同劑量生理鹽水，劑量均為2mL/100g，每12小時給藥1次，連續(xù)7d。采用盲法給藥，給藥由專人負責(zé)，造模者回避。

1.4 模型制備 采用Zea longa［4］基礎(chǔ)上改良的頸內(nèi)動脈線栓加環(huán)扎法。大鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征（梗死灶同側(cè)瞳孔縮小，眼裂變小，眼球內(nèi)陷）、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈爬行、提尾向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)、提尾倒立時對側(cè)前肢屈曲者為造模成功。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 除假手術(shù)組外，各組在再灌注的各時間點取動物用4%多聚甲醛固定，斷頭，以視交叉為中線取約4mm厚的腦組織，平分切成2mm厚的腦片，置于4%多聚甲醛中固定。常規(guī)石蠟包埋，切片機切片，片厚4μm。 兩套切片分別進行VEGF及CD34的SP法染色。檢測步驟嚴(yán)格按說明書進行操作。

1.6 圖像分析 VEGF陽性細胞評分標(biāo)準(zhǔn)：每只大鼠取相同部位的切片各3張，每張切片在鏡下（×400）隨機選取缺血區(qū)內(nèi)5個非重疊視野，計算陽性細胞數(shù)，取均值（陽性細胞數(shù)目/400倍視野）即代表該鼠陽性細胞數(shù)，再計算各組均值與標(biāo)準(zhǔn)差。CD34標(biāo)記微血管計數(shù)方法：以CD34染成棕色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇作為1個血管單位，但肌層較厚及管腔面積大于8個紅細胞直徑的血管不計數(shù)，首先用低倍鏡頭（×100）掃視整張切片，確定微血管最密集的3個視野（新生血管熱點區(qū)），然后在高倍鏡（×400）視野范圍內(nèi)計數(shù)所有染色的微血管，取3個視野計數(shù)結(jié)果的均數(shù)為該切片的微血管數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。計量資料采用（±s）表示，采用析因設(shè)計的方差分析。兩樣本比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組VEGF免疫組化結(jié)果 見表1。VEGF免疫陽性染色呈棕褐色，主要表達于梗死周邊區(qū)神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞等。假手術(shù)組梗死周邊區(qū)VEGF蛋白陽性表達極弱。模型組缺血6h即有表達，12h明顯增多，1d達到高峰，以后逐漸下降，一直持續(xù)到再灌注7d。芪棱湯去養(yǎng)陰藥組、芪棱湯組與模型組表達規(guī)律一致；再灌注6h，3組比較無顯著差異（P＞0.05）；再灌注 12h、1d、3d、7d，芪棱湯組、芪棱湯去養(yǎng)陰藥組與模型組比較均有顯著差異（P＜0.05或0.01）；芪棱湯組與芪棱湯去養(yǎng)陰藥組有顯著差異（P＜0.05或 0.01）。

2.2 各組CD34標(biāo)記微血管計數(shù)結(jié)果 見表2。CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細胞圍成。假手術(shù)組CD34在微血管無陽性表達。模型組CD34微血管在再灌注6h、12h、1d即有少量表達，在再灌注3d迅速上升，持繼升高至再灌注7d。芪棱湯去養(yǎng)陰藥組、芪棱湯組與模型組表達規(guī)律一致。再灌注各時間點，芪棱湯組、芪棱湯去養(yǎng)陰藥組與模型組比較均有顯著差異（P＜0．05或0．01），芪棱湯組與芪棱湯去養(yǎng)陰藥組有顯著差異（P＜0．05 或 0．01）。

表1 各組再灌注各時間點缺血周圍區(qū)VEGF陽性細胞數(shù) （個/視野，±s）

表1 各組再灌注各時間點缺血周圍區(qū)VEGF陽性細胞數(shù) （個/視野，±s）

與模型組比較，*P＜ 0．05，**P＜0．01；與芪棱湯去養(yǎng)陰藥組比較，△P＜0．05,△△P＜0．01。 下同。

組 別 n模型組 8芪棱湯去養(yǎng)陰藥組 8芪棱湯組 8 6h 15．51±2．58 17．44±1．26 18．16±1．81 12h 25．47±3．09 31．07±3．66*36．75±2．12**△1d 35．44±2．86 44．68±3．19**50．53±1．53**△3d 24．46±1．75 31．32±3．22**38．37±2．37**△7d 13．89±1．91 21．35±1．97**28．13±2．02**△△

表2 各組再灌注各時間點缺血周圍區(qū)微血管計數(shù) （個/視野，±s）

表2 各組再灌注各時間點缺血周圍區(qū)微血管計數(shù) （個/視野，±s）

組 別 n模型組 8芪棱湯去養(yǎng)陰藥組 8芪棱湯組 8 6h 8．69±1．98 12．45±1．48*16．02±2．25**△12h 13．36±3．95 19．83±3．44*22．99±2．32**△1d 23．48±3．02 31．29±3．08**34．63±2．81**△3d 50．28±4．56 63．35±2．40**71．30±3．99**△7d 61．61±2．86 74．45±2．85**82．82±3．36**△△

3 討 論

中醫(yī)學(xué)中增水行舟是指通過滋陰增液來治療陰（血）虛液虧便秘的方法。本法為清代醫(yī)家吳鞠通所創(chuàng)，主要針對陽明溫病“津液不足，無水舟?！敝按蟊悴幌隆倍O(shè)，后同代醫(yī)家周學(xué)海把養(yǎng)血活血法亦歸入本法范疇，認(rèn)為“夫血猶舟也，津液水也”。現(xiàn)增水行舟法已不再局限于便秘治療，已廣泛用于血栓性疾病的治療中，如腦缺血性疾病、靜脈血栓等疾病的治療。

缺血性中風(fēng)屬“血栓病”的范疇。其病機是腦部脈不通則血不流，內(nèi)結(jié)為血瘀所致的血痹于腦，肝腎陰虛所致的上實下虛是本病的根本，蓋津血本同源，陰精不足，脈道固澀，水枯舟停，脈絡(luò)瘀阻，瘀血內(nèi)結(jié)，瘀痹于腦，發(fā)為中風(fēng)。本課題組在“津血同源”、“陰虛致瘀”等理論的基礎(chǔ)上，給合多年臨床經(jīng)驗提出了“氣陰兩虛、瘀血阻絡(luò)”是缺血性中風(fēng)的又一重要病機，并在此基礎(chǔ)上運用“增水行舟”法之益氣養(yǎng)陰活血理論擬用芪棱湯，臨床中用于治療腦梗死等缺血性腦血管病，取得令人滿意的療效。

本研究發(fā)現(xiàn)VEGF表達規(guī)律有一個逐漸上升和下降的過程，在缺血6h即有較強表達，12h明顯增多，1d達到高峰，以后逐漸下降，一直持繼到再灌注7d。這符合AngⅡ?qū)ρ苌傻挠绊懪cVEGF呈依賴性的文獻報道。除缺血再灌注6h外，各相應(yīng)時間點12h、1d、3d、7d，芪棱湯組及芪棱湯去養(yǎng)陰藥組比模型組的VEGF表達明顯增多，且芪棱湯組與芪棱湯去養(yǎng)陰藥組有顯著差異。結(jié)果提示：腦缺血再灌注的超早期，芪棱湯和芪棱湯去養(yǎng)陰藥并不能促進VEGF表達，中藥制劑的獲效可能需要一個較長的治療過程；芪棱湯和芪棱湯去養(yǎng)陰藥均能上調(diào)VEGF表達，且芪棱湯的效果優(yōu)于芪棱湯去養(yǎng)陰藥，即益氣養(yǎng)陰活血法優(yōu)于益氣活血法。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組CD34標(biāo)記微血管在再灌注6h、12h、1d即有少量表達，在再灌注3d迅速上升，持繼升高至再灌注7d，表達高峰時間明顯晚于VEGF表達的時間，提示：微血管的增生可能是VEGF促進的結(jié)果；VEGF啟動血管生成需要一個時間過程。再灌注各時間點，芪棱湯組、芪棱湯去養(yǎng)陰藥組與模型組比較均有顯著差異，芪棱湯組與芪棱湯去養(yǎng)陰藥組有顯著差異。結(jié)果提示：芪棱湯及芪棱湯去養(yǎng)陰藥可能通過刺激VEGF表達，促進血管生成；芪棱湯的促進血管生成效果優(yōu)于芪棱湯去養(yǎng)陰藥，即益氣養(yǎng)陰活血法優(yōu)于益氣活血法。

［1］ 楊冀萍，劉新峰．血管內(nèi)皮生長因子治療性血管生成作用與缺血性腦血管病［J］．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13（7）：1354－1360．

［2］ Szpak GM ，LechowiczW，Lewandowska E， etal．Border zone neovascularization in cereral ischemic infarct［J］．Folia Neuropathol，1999，37（4）：264－268．

［3］ 邢影，徐忠信，莽靖，等．大腦局灶性腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮細胞生長因子表達的研究［J］．中國危重病急救醫(yī)學(xué)， 2005，17（3）：174－176．

［4］ Zea Longa E，Weinsten P R，Carlom S．Reversible middle cerebral artery occlusion withoutcraniectomy in rat［J］．Stroke，1989，20（1）：84-91．