抗人CD25嵌合抗體基因的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá)研究

胡迪超 張愛(ài)華 潘勇兵 詹珊珊 楊曉明 (武漢生物制品研究所,武漢430060)

抗人CD25嵌合抗體基因的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá)研究

胡迪超 張愛(ài)華 潘勇兵 詹珊珊 楊曉明 (武漢生物制品研究所,武漢430060)

目的:構(gòu)建抗人CD25嵌合抗體基因并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)和初步鑒定。方法:采用RLM-R ACE法克隆WuTac抗體可變區(qū)和信號(hào)肽序列,并利用基因拼接法構(gòu)建嵌合抗體基因。用脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染三種哺乳動(dòng)物細(xì)胞,并使用ELISA、FCM、WB、Dot blot和免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:成功克隆WuTac抗體可變區(qū)和信號(hào)肽序列,并構(gòu)建了抗人 CD25嵌合抗體表達(dá)質(zhì)粒。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染結(jié)果表明所表達(dá)的嵌合抗體保留了親本抗體WuTac的抗原結(jié)合力。結(jié)論:成功構(gòu)建了抗人CD25嵌合抗體基因,為其進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

CD25;RLM-R ACE;基因拼接;嵌合抗體;瞬時(shí)表達(dá)

IL-2通過(guò)與IL-2R結(jié)合而活化T細(xì)胞,高親和力的IL-2R 由α鏈 (CD25,Tac,P55)、β鏈 (CD122, P70-75)和γ鏈(CD132,P64)三個(gè)亞基組成[1]。人CD25分子為Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面,是IL-2的特異性受體,而IL-2Rβ和IL-2Rγ也可作為IL-15R的受體;因此,以CD25為靶標(biāo)治療疾病有著很大的潛力[2]。以人CD25為靶標(biāo)上市的治療性單抗國(guó)外有舒萊(SIMULECT○R,嵌合抗體)和賽呢派 (ZENAPAX○R,人源化抗體),而國(guó)產(chǎn)賽呢派(健尼哌○R,上海中信國(guó)健藥業(yè)股份有限公司)也于2011年1月12日獲得藥品批準(zhǔn)文號(hào)。抗CD25抗體治療疾病的作用機(jī)制是:(1)抑制了IL-2R的β、γ鏈異二聚化;(2)不能激活酪氨酸激酶Jak3;(3)酪氨酸殘基和STAT的磷酸化發(fā)生障礙,從而阻斷了T細(xì)胞的活化和增殖;(4)通過(guò)ADCC和固定補(bǔ)體發(fā)揮功能[3,4]。雖然賽呢派在器官移植、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、白血病和糖尿病領(lǐng)域也顯示出潛力,但其親和力(3×109M-1)只有親本抗體抗-Tac單抗的1/3(9×109M-1)[5]。嵌合抗體不僅降低了HAMA(Human anti-mouse antibody)反應(yīng),而且還保留了親本抗體的特異性和親和力;而上市的5個(gè)嵌合抗體中有3個(gè)都為重磅炸彈,因此將其進(jìn)行嵌合抗體改造仍是一種理想的策略。

本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了一株抗人CD25鼠源性單克隆抗體(WuTac),目前已經(jīng)完成抗腎臟移植排斥反應(yīng)Ⅰ期臨床研究。由于鼠源性單抗用于人體治療存在局限性,因此本研究嘗試將其進(jìn)行人鼠嵌合抗體改造。傳統(tǒng)的用一組簡(jiǎn)并引物釣取抗體可變區(qū)的方法存在一定的缺陷,如造成氨基酸突變,不能準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增出抗體的信號(hào)肽序列等[6];因此,采用RLM-RACE(RNA ligase-mediated-Rapid amplification of cDNA ends)法不僅能釣取抗體的可變區(qū)序列和信號(hào)肽序列,而且還能釣取抗體的5′-UTR,從而為鼠單抗的改造打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、菌株及質(zhì)粒 分泌WuTac單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株由本室制備并保存;HEK 293T、CHO-DHFR-及COS-7細(xì)胞由本室保存;Top 10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;含有人IgG1κ恒定區(qū) cDNA序列的質(zhì)粒 pMD18-CH和pMD18-CK由本室構(gòu)建并保存(宿主細(xì)胞為DH5α);質(zhì)粒pcDNA3.3-stuffer和pOptiVEC-stuffer(填充序列兩端均含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn),宿主細(xì)胞為DH5α)由本室構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑 TRIzol試劑(Cat.No.15596-062)、Opti-MEM○RⅠ Reduced Serum Media(Cat.No.31985-026)及 LipofectamineTM2000(Cat.No.11668-019)購(gòu)自Invitrogen 公司 ;5′-Full RACE kit(D315)、PrimeSTAR○RHS DNA Polymerase with GC Buffer(DR0044A)、DNA A-Tailing kit(D404)和 pMD○R18-T Vector(D101B)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;FastDigest○REcoR Ⅰ(#FD0274)和 FastDigest○RXho Ⅰ (#FD0694)購(gòu)自Fermentas公司;LigaFastTMRapid DNA Ligation System (M8221)購(gòu)自Promega公司;山羊抗人Kappa鏈多克隆抗體(Cat.No.2060-01)、TRITC標(biāo)記的山羊抗人Kappa鏈多克隆抗體(Cat.No.2060-03)和HRP標(biāo)記的山羊抗人IgG(Fc specific)多克隆抗體(Cat.No. 2047-05)購(gòu)自SouthernBiotech公司;FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG(Fc specific)多克隆抗體(F9512)、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(Fab specific)的F(ab')2片段(F8521)以及人IgG1 Kappa參考品(15154-1MG,純度＞95%)購(gòu)自Sigma公司;HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)多克隆抗體(Cat.No.474-1806)購(gòu)自KPL公司;QIAquickGel Extraction Kit(Cat.No.28706)、QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106)以及HiSpeed Plasmid Midi kit(Cat.No.12643)購(gòu)自QIAGEN公司;人源細(xì)胞表達(dá)的重組人IL-2Rα(CD25)分子(10165-H08H)購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司;增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑(PA110)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) WuTac雜交瘤細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),HEK 293T用MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),CHO-DHFR-用IMDM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,100 μ mol/L 次黃嘌呤和 16 μ mol/L 胸腺嘧啶),COS-7用DMEM(含10%胎牛血清),人外周血單核細(xì)胞(PBMC)用DMEM(含10%胎牛血清和10 μ g/ml植物血凝素)均于37 ℃下、含5%CO2的孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 相關(guān)引物 pMD18-T多克隆位點(diǎn)兩端的引物: RV-M:5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′,M13-47:5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′;pcDNA3.3和pOptiVEC多克隆位點(diǎn)兩端的引物:CMV-F:5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′,TK poly:5′-CTTCCGTGTTTCAGTTAGC-3′,EMCV IRES:5′-CCTTATTCCAAGCGGCTTCG-3′;用于構(gòu)建嵌合抗體基因的引物: 5HP1:5′-CCGGAATTCGCCGCCACCATGGAATGTAAC TGGATAC-3′(EcoR Ⅰ),5HP2:5′-CTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTT-3′,5HP3:5′-AGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCAT-3′,5HP4:5′-CCGCTCGAGAGCTCATTTACCCGGAGACAGGGA-3′(Xho Ⅰ), 5LP1:5′-CCGGAATTCGCCGCCACCATGGTGTCCTCTGCTCAGTTCCT-3′(EcoR Ⅰ ),5LP2:5′-TGGTGCAGCCACAGTTTTGATTTCCAACTTGGTGCCTCC-3′,5LP3:5′-GGAAATCAAAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC-3′,5LP4: 5′-CCGCTCGAGAGCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3′(XhoⅠ);以上引物均由金斯瑞生物科技合成。

1.5 WuTac單抗可變區(qū)和信號(hào)肽序列的克隆 收集5×106～10×106個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的WuTac雜交瘤細(xì)胞,利用TRIzol試劑一步法提取總RNA,然后采用RLM-RACE法聯(lián)合巢氏PCR和遞減PCR法擴(kuò)增目的片段,凝膠純化回收目的片段后按照DNA ATailing kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加“A”尾;再分別與 pMD18-T載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定陽(yáng)性克隆后各挑15個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定并比對(duì)分析。

1.6 抗人CD25嵌合抗體基因真核共表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 使用常規(guī)PCR法分別擴(kuò)增WuTac單抗的可變區(qū)和信號(hào)肽序列以及人IgG1κ的恒定區(qū)序列,并凝膠純化回收目的片段;參考文獻(xiàn)[7]采用基因拼接法分別構(gòu)建抗人CD25嵌合抗體基因的重鏈和輕鏈,并對(duì)目的片段進(jìn)行凝膠純化回收;EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切純化回收的嵌合重、輕鏈以及質(zhì)粒pcDNA3.3-stuffer和pOptiVEC-stuffer,凝膠純化回收目的片段并進(jìn)行定量;按照LigaFastTMRapid DNA Ligation System使用說(shuō)明分別將嵌合重鏈基因與pOptiVEC載體以及嵌合輕鏈與pcDNA3.3載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化Top 10感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定陽(yáng)性克隆后各挑4個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定并比對(duì)分析。

1.7 抗人CD25嵌合抗體真核共表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染前一天,將生長(zhǎng)匯合度約90%的細(xì)胞胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度為1× 105～ 4×105個(gè)/ml,500 μ l/孔接種于 24 孔板中;按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)稀釋質(zhì)粒DNA和脂質(zhì)體 ,以 1 μ g∶2 μ l、1 μ g∶3 μ l、1 μ g∶4 μ l、1.5 μ g∶2 μ l、1.5 μ g∶3 μ l和 1.5 μ g∶4 μ l的比例瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HEK 293T 、CHO-DHFR-和COS-7細(xì)胞,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染6小時(shí)后更換新鮮的完全培養(yǎng)基;轉(zhuǎn)染后每隔24小時(shí)每孔取100 μ l上清液待檢測(cè),并補(bǔ)加100 μ l新鮮的完全培養(yǎng)基,直到轉(zhuǎn)染后192小時(shí)。

1.8 雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)表達(dá)上清中的抗體濃度 棋盤(pán)滴定法確定包被抗體的濃度和二抗的工作濃度;將轉(zhuǎn)染后的上清液進(jìn)行對(duì)倍稀釋,96孔ELISA 板(Corning)中每孔加入待檢樣品100 μ l,以轉(zhuǎn)染的空質(zhì)粒上清液和正常細(xì)胞上清液作陰性對(duì)照,人 IgG1 Kappa 參考品以 100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 ng/ml和0.78 ng/ml進(jìn)行加樣,37℃濕盒中孵育1小時(shí)后洗板機(jī)(Biotek)洗板5次,每次均設(shè)置振動(dòng);然后每孔加入稀釋的二抗 100 μ l,37℃濕盒中孵育30分鐘后洗板(同上);每孔加入100 μ l顯色液,37℃濕盒中孵育10分鐘后每孔加入2 mol/L的H2SO450 μ l進(jìn)行終止 ,并用酶標(biāo)儀(Biotek)讀取 OD 450/630數(shù)值。

1.9 表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)合活性檢測(cè)

1.9.1 流式細(xì)胞術(shù) 將分離的人PBMC用PHA培養(yǎng)刺激5天,吹打均勻后調(diào)整細(xì)胞濃度5×105個(gè)/ ml以上;微量反應(yīng)板中每孔加入靶細(xì)胞 50 μ l,然后分別加入待檢樣品100 μ l,以轉(zhuǎn)染的空質(zhì)粒上清液和正常細(xì)胞上清液作陰性對(duì)照,以1μ g/ml WuTac單抗作陽(yáng)性對(duì)照;輕輕混勻后,4℃孵育30分鐘;以含5%FBS的PBS(pH7.4)洗3次,每次1 200 r/min離心2分鐘收集細(xì)胞;FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG(Fc specific)和山羊抗小鼠IgG(Fab specific)的F(ab')2片段分別以1∶64和 1∶200稀釋,每孔加入100 μ l重懸細(xì)胞;4℃孵育30分鐘后進(jìn)行洗滌(同上);然后每孔加入2%多聚甲醛100 μ l進(jìn)行固定,上機(jī)前補(bǔ)加150 μ l PBS(pH7.4),輕輕混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.9.2 Western blot 將重組人CD25抗原稀釋至100 μ g/ml,以 3∶1 的比例與 4×SDS loading buffer混勻,100℃孵育5分鐘,12 000 r/min離心1分鐘;分離膠為12%、濃縮膠為3%的SDS-PAGE膠中,每孔上樣10 μ l;電泳完畢后轉(zhuǎn)NC膜(Pall);5%脫脂奶粉(PBS配)4℃封閉過(guò)夜;PBST(0.05%Tween-20)沖洗2次后洗滌3次,5分鐘/次,溫和振蕩;將轉(zhuǎn)膜加入對(duì)應(yīng)的表達(dá)上清液中,室溫溫和振蕩2小時(shí);如前洗滌后分別加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和山羊抗人IgG-Fc分別以1∶10 000和1∶5 000稀釋)室溫溫和振蕩30分鐘;如前洗滌后用增強(qiáng)型DAB顯色液進(jìn)行顯色。

1.9.3 Dot blot 將NC膜于PBS中浸泡30分鐘后自然晾干;對(duì)應(yīng)的標(biāo)記處點(diǎn)樣3 μ l 100 μ g/ml的重組人CD25抗原,自然晾干后于5%脫脂奶粉中4℃封閉過(guò)夜;洗滌、孵育、一抗、二抗和顯色條件均同1.9.2。

1.10 免疫熒光法對(duì)表達(dá)的嵌合抗體進(jìn)行檢測(cè) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染步驟同 1.7;轉(zhuǎn)染 48小時(shí)后用預(yù)冷 PBS (pH7.4)洗滌CHO-DHFR-細(xì)胞3次,然后用 80%冷丙酮-20℃固定30分鐘;預(yù)冷PBS洗滌 3次,5 min/次;TRITC標(biāo)記的山羊抗人Kappa鏈多抗按1∶1 000及FITC標(biāo)記的山羊抗人IgG-Fc多抗按1∶64稀釋后4℃孵育過(guò)夜;如前洗滌后用蒸餾水洗一次;然后加入適量封固劑(0.5 mol/L的pH9.0碳緩與甘油等比例混勻)并用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察(Leica)。

2 結(jié)果

2.1 WuTac可變區(qū)及信號(hào)肽序列的克隆與序列分析 以WuTac雜交瘤細(xì)胞的總RNA為模板,利用RLM-RACE法均擴(kuò)增出含有抗體重、輕鏈可變區(qū)及信號(hào)肽的基因片段,大小分別為650 bp和500 bp左右,與預(yù)期片段大小相符,見(jiàn)圖1;經(jīng)序列分析:Wu-Tac單抗重鏈可變區(qū)基因長(zhǎng)度為411 bp,屬于VH1亞組,編碼137個(gè)AA,前19個(gè)AA為信號(hào)肽,并擴(kuò)增出 5′-UTR,其長(zhǎng)度為 55 bp(GenBank登錄號(hào): JF412709);WuTac單抗輕鏈可變區(qū)基因長(zhǎng)度為381 bp,屬于VK10亞組,編碼127個(gè)AA,前 20個(gè)AA為信號(hào)肽,并擴(kuò)增出長(zhǎng)度為 31 bp的5′-UTR(GenBank登錄號(hào):JF412710)。

2.2 抗人CD25嵌合抗體基因的構(gòu)建 常規(guī)PCR法擴(kuò)增鼠的可變區(qū)序列和人的恒定區(qū)序列,然后采用基因拼接法分別構(gòu)建嵌合抗體基因的重、輕鏈;瓊脂糖凝膠電泳分析表明:均獲得了目的片段,見(jiàn)圖2。

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后上清液中的嵌合抗體濃度 以雙抗體夾心ELISA檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后8天內(nèi)上清液中的嵌合抗體濃度,陰性對(duì)照OD值均小于0.1,以人IgG1 Kappa參考品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,r2均大于0.99,結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 瞬時(shí)表達(dá)嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性分析流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,三種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的嵌合抗體均能與人PBMC上的CD25分子特異性結(jié)合,且保留了親本抗體的結(jié)合力;WB及斑點(diǎn)雜交結(jié)果亦表明其能與重組人CD25分子特異性結(jié)合,且可能識(shí)別的是人CD25分子的線性表位;見(jiàn)圖4。

2.5 免疫熒光分析 免疫熒光結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染含嵌合抗體基因質(zhì)粒的細(xì)胞均呈現(xiàn)出綠色熒光(FITC)和紅色熒光(TRITC),而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞未見(jiàn)熒光,說(shuō)明所表達(dá)的嵌合抗體含有人抗體的重、輕鏈恒定區(qū),見(jiàn)圖 5。

圖1 RLM-RACE法克隆WuTac單抗可變區(qū)結(jié)果Fig.1 Results of variable region genes of WuTac cloned by RLM-RACE technique

圖2 抗人CD25嵌合抗體基因的構(gòu)建Fig.2 Construction of chimeric antibody gene against human CD25 antigen

3 討論

CD25為白細(xì)胞介素2受體的α亞基(IL-2Rα),是治療同種異型移植物排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病和惡性血液病的重要靶點(diǎn)之一[8]。當(dāng)前,上市的抗CD25嵌合抗體或人源化抗體均表現(xiàn)出良好的有效性、安全性和成本效益比[9]。

傳統(tǒng)的用于克隆抗體可變區(qū)的方法是用一組簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增,而抗體可變區(qū)高度可變,簡(jiǎn)并引物很難與所有的抗體可變區(qū)序列完全匹配,結(jié)果可能導(dǎo)致無(wú)法擴(kuò)增或擴(kuò)增出的序列發(fā)生了突變。鑒于此,本研究采用RLM-RACE法不僅擴(kuò)增出WuTac抗體可變區(qū)序列和信號(hào)肽序列,而且還擴(kuò)增出 5′-UTR[10]。而經(jīng)典方法并沒(méi)有準(zhǔn)確地克隆出WuTac抗體重鏈信號(hào)肽序列[11]?？勺儏^(qū)序列是保持抗體親和力和特異性的關(guān)鍵,而信號(hào)肽序列在抗體的分泌表達(dá)中起重要作用,5′-UTR可能與抗體的表達(dá)水平有關(guān)[12]。

圖3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后上清液中的嵌合抗體濃度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Concentration of chimeric antibody in culture supernatants of transiently transfected cells examined by Sandwich ELISA method

圖4 抗CD25嵌合抗體的抗原結(jié)合特異性分析Fig.4 Antigen binding specificity of expressed chimeric antibody against CD25 analyzed by FCM,WB and Dot blot

圖5 免疫熒光法檢測(cè)抗CD25嵌合抗體基因的表達(dá)(×400)Fig.5 Expression of chimeric antibody gene against CD25 examined by immunofluorescence assay(×400)

為了確認(rèn)所釣取的抗體可變區(qū)是WuTac抗體序列,本研究將構(gòu)建的抗人CD25嵌合抗體共表達(dá)質(zhì)粒在三種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)研究。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染后HEK 293T和CHODHFR-細(xì)胞上清液中的抗體濃度較恒定,而COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染后第5天抗體濃度就明顯下降,這可能與細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān):前兩者能夠維持較高的細(xì)胞密度而不死亡,而COS-7細(xì)胞長(zhǎng)滿整瓶后不傳代就開(kāi)始死亡,從而導(dǎo)致內(nèi)源性蛋白酶釋放而將抗體消化掉。同時(shí),包被抗體針對(duì)人Kappa鏈,而二抗針對(duì)人IgG-Fc區(qū),從而確保檢測(cè)物為完整的抗體分子且含有人抗體重、輕鏈恒定區(qū)。FCM結(jié)果表明,三種細(xì)胞中表達(dá)的嵌合抗體均保留了親本抗體的結(jié)合力。其檢測(cè)值比陽(yáng)性對(duì)照低可能是由于所用的二抗為山羊抗小鼠Fab,因?yàn)樗磉_(dá)的嵌合抗體只有可變區(qū)是鼠源的,而恒定區(qū)更易被識(shí)別和結(jié)合。圖4中004所用的二抗為山羊抗人IgG-Fc,其檢測(cè)值與陽(yáng)性對(duì)照無(wú)差異。WB和Dot blot結(jié)果表明,三種細(xì)胞中表達(dá)的嵌合抗體均能特異性識(shí)別人CD25抗原,且可能識(shí)別的是其線性表位。非還原型SDSPAGE中除了目的條帶外(44 kD),均出現(xiàn)了約72 kD的條帶,這可能是重組人CD25抗原中存在的二聚體。免疫熒光結(jié)果表明,所表達(dá)的嵌合抗體含有人抗體重、輕鏈恒定區(qū)。

本研究對(duì)構(gòu)建的抗人CD25嵌合抗體基因進(jìn)行了瞬時(shí)表達(dá)研究,為其下一步穩(wěn)定表達(dá)打下了基礎(chǔ)。

1 Taniguchi T,Minami Y.The IL-2/IL-2 receptorsystem:a current overview [J].Cell,1993;73(1):5-8.

2 Li J,Li X Y,Li B R et al.Two doses of humanized anti-CD25 antibody in renal transplantation[J].mAbs,2009;1(1):49-55.

3 楊振林,秦玉峰,鄭樹(shù)森.IL-2受體α單克隆抗體的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·移植與血液凈化分冊(cè),2004;2(3):11-13.

4 Church A C.Clinical advances in therapies targeting the interleukin-2 receptor[J].QJM,2003;96(2):91-102.

5 Tsurushita N,Hinton P R,Kumar S.Designof humanized antibodies:From anti-Tac to Zenapax[J].Methods,2005;36(1):69-83.

6 Ruberti F,Cattaneo A,Bradbury A.The use of the RACE method to clone hybridoma cDNA when V region primers fail[J].J Immunol Methods, 1994;173:33-39.

7 胡迪超,張愛(ài)華,楊曉明.人鼠嵌合抗體的基因構(gòu)建[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2009;22(9):933-936.

8 Morris J C,Waldmann T A.Advances in interleukin 2 receptor targeted treatment[J].Ann Rheum Dis,2000;59(supplⅠ):i109-i114.

9 尤平洪,盧一平.一種新型的IL-2R受體阻滯劑——抗CD25單克隆抗體[J].華西醫(yī)學(xué),2007;22(3):659-660.

10 Liu X,Gorovsky M A.Mapping the 5′and 3′ends of Tetrahymena thermophila mRNAs using RNA ligase mediated amplification of cDNA ends (RLM-RACE)[J].Nucleic Acids Res,1993;21(21):4954-4960.

11 潘勇兵,張愛(ài)華,胡迪超 et al.抗CD25人鼠嵌合抗體基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與瞬時(shí)表達(dá)[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2010;23 (2):113-117.

12 Knappskog S,Ravneberg H,Gjerdrum C et al.The level of synthesis and secretion of Gaussia princeps luciferase in transfected CHO cells is heavily dependent on the choice of signal peptide[J].J Biotechnol,2007;128 (4):705-715.

[收稿2011-02-01 修回2011-03-17]

(編輯 張曉舟)

Study on construction and transient expression of human-mouse chimeric antibody gene against human CD25

HU Di-Chao,ZHANG Ai-Hua,PAN Yong-Bing,ZHAN Shan-Shan,YANG Xiao-Ming.Wuhan Institute of Biological Products,Wuhan 430060,China

Objective:To construct chimeric antibody gene against human CD25 antigen,and preliminarily identify the expressed products produced from transiently transfected mammalian cells in order to facilitate the further study of stable expression.MethodsThe RLMRACE was employed to clone variable region genes and leader sequences,and the Overlap PCRmethodwasused to construct the chimeric antibody gene.After transiently transfected in three mammalian cells with liposome method,the expressed products were determined by ELISA, FCM,WB,Dot blot and immunofluorescence assay.ResultsThe variable region genes and leader sequenceswere successfully amplified,andthe eukayotic expression plasmidswere constructed.The results from transient transfectionindicate the expressed products retain the antigen binding capacity of parental antibody WuTac.ConclusionThe successfully constructed chimeric antibody gene against human CD25 lays a sound foundation for further study.

CD25;RLM-RACE;Gene splicing;Chimeric antibody;Transient expression

R392.11

A

1000-484X(2011)07-0648-06

10.3969/j.issn.1000-484X.2011.07.016

胡迪超(1980年-),男,在讀博士,主要從事抗體工程研究,E-mail:hudc2008@yahoo.cn;

及指導(dǎo)教師:楊曉明(1962年-),男,醫(yī)學(xué)碩士,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事細(xì)菌類疫苗研究,E-mail: xmyang@wibp.com.cn。

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·