規(guī)?；u場大腸桿菌的分離與藥敏試驗

張 寧 李賀俠 （安徽省和縣畜牧獸醫(yī)局 安徽和縣 238200）

規(guī)?；u場大腸桿菌的分離與藥敏試驗

張 寧 李賀俠 （安徽省和縣畜牧獸醫(yī)局 安徽和縣 238200）

對某規(guī)?；u場發(fā)生的疾病進行調(diào)查，根據(jù)臨床癥狀、病理變化將疑似大腸桿菌病20份病雞的肝臟樣品經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)、鏡檢和生化試驗等實驗室方法分離鑒定出18株大腸桿菌。動物實驗表明所分離的大腸桿菌均具有很強的致病性。用臨床上常用的9種抗菌藥物對分離菌株進行藥敏試驗，結(jié)果表明，所分離的大腸桿菌對阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和頭孢噻呋高度敏感，對慶大霉素中度敏感，對青霉素、紅霉素、恩諾沙星和鏈霉素等產(chǎn)生耐藥性。

雞 大腸桿菌 分離鑒定 藥敏試驗

雞的大腸桿菌病是由大腸桿菌中的某些致病菌株引起的一類疾病的總稱，各品種和年齡的雞均可發(fā)生。本病一年四季均可發(fā)生，但以冬春和氣溫多變季節(jié)多發(fā)，常與慢性呼吸道病、新城疫等病混合感染，同時也與飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)和應(yīng)激等因素密切相關(guān)。近年來，隨著我縣養(yǎng)雞業(yè)的日益發(fā)展和集約化程度的提高，本病也是我縣養(yǎng)雞業(yè)發(fā)病率較高、危害較為嚴(yán)重的疾病之一。大腸桿菌對藥物極易產(chǎn)生抗藥性，因此應(yīng)在感染早期對分離出的大腸桿菌進行藥敏試驗，選擇對禽大腸桿菌病最敏感有效的或選用本場過去少用的藥物全群給藥。

本試驗首先根據(jù)病死雞的臨床癥狀和病理變化等作出初步診斷，并通過實驗室檢查確診。通過藥物敏感試驗選擇對大腸桿菌敏感的藥物，提出治療方案，推薦給廣大養(yǎng)殖戶，以減少大腸桿菌病帶來的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

2010年11月采自某規(guī)模化雞場20份病死雞的肝臟。

1.1.2 儀器與試劑

阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋、慶大霉素、青霉素、紅霉素、恩諾沙星和鏈霉素藥敏紙片均由杭州微生物制品有限公司生產(chǎn)。麥康凱培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、顯微鏡、冰箱和常用玻璃儀器等均由和縣畜牧獸醫(yī)局實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 染色鏡檢

無菌操作采集病死雞的肝臟組織，涂片進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

無菌操作取病死雞的肝臟組織分別接種于普通瓊脂和麥糠凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，挑取培養(yǎng)基上的獨立單在的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，分別取上述菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，在油鏡下觀察細(xì)菌的形態(tài)及染色特性。觀察是否存在雜菌。對于已經(jīng)純化的細(xì)菌進行冷凍保存，未純化的重復(fù)劃平板，鏡檢，直至純化為止。

1.2.3 生化試驗

自制各種糖發(fā)酵管，取純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇等生化管中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18～24h，觀察發(fā)酵管的反應(yīng)情況。按文獻[1]要求自制各種生化試劑，取純培養(yǎng)物分別做M.R.試驗、V-P試驗、硫化氫試驗和靛基質(zhì)試驗。

1.2.4 動物實驗

190 只健康30日齡雛雞隨機分為19組，每組10只，第1組至第18組為實驗組，分別腹腔接種分離的18株大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物，每只0.2mL，第19組為對照組，常規(guī)飼養(yǎng)。觀察發(fā)病情況，于雛雞死后，剖檢觀察病理變化，并且無菌操作采心血涂片，革蘭氏染色，鏡檢。

1.2.5 藥敏試驗

對分離到的18株菌株進行了藥敏試驗，共檢測9種藥物，包括阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻呋、慶大霉素、青霉素、紅霉素、恩諾沙星和鏈霉素。根據(jù)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)[2]判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 剖檢變化

經(jīng)剖檢可見：病死雞剖檢均發(fā)現(xiàn)以肝周炎、心包炎變化為主，即俗稱“包心包肝”。特異性惡臭味，腹腔有積液，呈淺黃色。

2.2 染色鏡檢結(jié)果

肝臟涂片革蘭氏染色鏡檢，均為陰性小桿菌，單個散在，兩端鈍圓，表面光滑濕潤，兩極著色較深，邊緣整齊的小菌群。符合大腸桿菌的形態(tài)特征[3]，結(jié)合臨床癥狀和病理變化，初步判斷為大腸桿菌感染。

2.3 細(xì)菌分離

分離菌經(jīng)37℃培養(yǎng)24h，在麥糠凱瓊脂上形成紅色、圓形、隆起、光滑濕潤及邊緣整齊的中等大菌落，在普通瓊脂斜面上為灰白色菌落，培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色，鏡檢，可見到革蘭氏陰性、兩端鈍圓的小桿菌。

2.4 生化試驗結(jié)果

各分離菌株均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；能產(chǎn)生靛基質(zhì)，不產(chǎn)生硫化氫；M.R.試驗為陽性，V-P試驗為陰性。試驗結(jié)果符合大腸桿菌的生化特征。

2.5 動物試驗結(jié)果

對照組10只仔雞存活，無臨床癥狀。攻毒組接種后12h開始發(fā)病，24h后全部發(fā)病，于72h陸續(xù)死亡。死前癥狀為精神沉郁，食欲不振，腹瀉，拉黃白稀糞，離群呆立，昏睡，符合雞大腸桿菌病的臨床癥狀。死后剖檢可見大腸桿菌典型病變，無菌操作取發(fā)病雞的肝臟涂片、染色和鏡檢，鏡下觀察可見兩端鈍圓的短小桿菌，單個或成對存在，兩極著色較深，革蘭氏染色陰性。生化試驗結(jié)果同2.4，從而證明，動物實驗的仔雞被大腸桿菌感染。

2.6 藥敏試驗

測量藥敏紙法的抑菌圈直徑，取平均值的結(jié)果見表1。結(jié)果表明，所分離大腸桿菌對阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和頭孢噻呋高度敏感，對慶大霉素中度敏感，對青霉素、紅霉素、恩諾沙星和鏈霉素等產(chǎn)生耐藥性。

3 討論

本次試驗分離的18株細(xì)菌的革蘭氏染色涂片細(xì)菌的形態(tài)皆與雞大腸桿菌的形態(tài)特征一致，18株細(xì)菌的生化試驗結(jié)果一致，且與雞大腸桿菌的生化特征一致，可斷定這些菌株屬于大腸桿菌。

表1 分離細(xì)菌的藥敏試驗結(jié)果

從本次的藥敏試驗結(jié)果可以看出，該批大腸桿菌分離株對阿莫西林、丁胺卡那霉素、氟苯尼考和頭孢噻呋高度敏感，對慶大霉素中度敏感，對青霉素、紅霉素、恩諾沙星和鏈霉素等產(chǎn)生耐藥性。建議各養(yǎng)殖場治療雞大腸桿菌病時，臨床上應(yīng)嚴(yán)格掌握抗菌藥物的適當(dāng)使用，防止錯用、濫用抗菌藥，最好先做藥敏試驗，選出敏感藥物進行有效治療，結(jié)合藥敏試驗結(jié)果考慮聯(lián)合用藥和交替用藥。投藥與應(yīng)用大腸桿菌多價疫苗相結(jié)合，盡量減少損失。

大腸桿菌是一種條件致病菌，常在一定條件下轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏〔≡?，如：飼養(yǎng)管理不當(dāng)、環(huán)境較差或家禽的抵抗力低等情況下，家禽機體受到侵害引發(fā)大腸桿菌病。所以，對于雞場大腸桿菌病的防治不能僅僅依靠藥物，應(yīng)采取綜合防制措施，建立規(guī)?；u場生物安全體系，最大可能地減少雞場內(nèi)的病原微生物，降低雞場病原感染幾率，從而促進養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。

[1]姚火春．獸醫(yī)微生物實驗指導(dǎo)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2002,36-42．

[2]王輝，陳民鈞，徐英春．簡要介紹美國NCCLS藥敏試驗紙片擴散法法規(guī)(續(xù))[J]．中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1995，18(2)：118-124．

[3]陸承平主編．獸醫(yī)微生物學(xué)[M]（第三版）.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，200l，217．

[4]魏蕻,朱曉霞,鄧一科,等.雞源大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗[J].西南民族大學(xué)學(xué)報．自然科學(xué)版,2009,5（35）：1020-1023.

S859.7

A

1008-3847（2011）06-0040-02

*通訊作者：張寧（1981-），安徽蒙城人，主要從事動物衛(wèi)生監(jiān)督工作。

聯(lián)系方式：li-hexia@163.com

丁煥中