人骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)及其生物學(xué)特性分析

李洪偉，郭開今，周 冰，辛 兵，陳向陽，葛保健

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，江蘇徐州221002)

人骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)是骨髓中存在的一類非造血組織干細胞，具有高度增殖和自我更新能力，并具有多向分化潛能，它不僅能分化為中胚層的成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等［1］，還可跨胚層分化為肝細胞［2］、神經(jīng)細胞［3］、心肌細胞［4］，已成為組織工程、基因治療和再生醫(yī)學(xué)中的研究熱點。由于骨髓中細胞成分比較混雜，MSC在骨髓中的含量極少，僅占骨髓中有核細胞的0.001%～0.01%，實際應(yīng)用中需對其進行體外分離純化并大量擴增。2009年3月～2010年2月，為尋找適宜MSC體外分離、培養(yǎng)和擴增方法，并分析其生物學(xué)特性，我們進行了相關(guān)實驗。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 Percoll分離液(Pharmacia公司)，藻紅蛋白(PE)標記鼠抗人CD90、CD105單克隆抗體和異硫氰酸熒光素(FITC)標記鼠抗人CD34、CD11b單克隆抗體，RNase、碘化丙啶(PI)，牛血清白蛋。倒置相差顯微鏡，流式細胞儀。

1.2 MSC分離及培養(yǎng)方法

1.2.1 MSC的分離 無菌條件下從健康成人志愿者的髂骨處抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，輕輕搖勻，用DMEM培養(yǎng)基稀釋1倍容積后，緩慢加入等量的Percoll分離液，2 500 r/min離心30 min，收集白膜層的單個核細胞，以PBS洗滌離心2次，按2×105/cm2密度接種于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基5 ml，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.2.2 MSC的原代培養(yǎng) 接種后48 h進行首次半換液，棄未貼壁細胞，補充培養(yǎng)基;間隔2 d再次半換液，去除未貼壁細胞。以后細胞隔日洗滌、全量換液，使細胞逐漸純化。

1.2.3 MSC的傳代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)細胞生長至80%～90%融合時，棄原培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，用0.25%胰蛋白酶溶液消化3～5 min，倒置顯微鏡下觀察大部分細胞逐漸趨于圓形，但尚未脫落時將溶液棄去，胎牛血清終止消化。用吸管將貼壁的細胞輕柔吹打成懸液，離心收集細胞，獲原代MSC，按1∶3的比例傳代，并標記為P1，在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)，2～3 d換液1次。待細胞達80%以上融合后，重復(fù)以上操作，進行傳代，標記為P2，余類推。

1.3 細胞生長曲線繪制及細胞生物學(xué)活性檢測

1.3.1 細胞生長曲線繪制 取生長狀態(tài)良好的P1、P3、P5細胞，消化成單細胞懸液后，以1×104孔接種于24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。每天同一時間取3孔細胞消化計數(shù)，每孔計數(shù)3次，計算平均值，連續(xù)測定7 d。繪制細胞生長曲線。

1.3.2 細胞表面抗原檢測 取第3代生長融合達80%的貼壁細胞，PBS洗滌后，以0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，計數(shù)后取2×106個細胞并分裝6管，以含2%牛血清白蛋白的PBS洗滌。每管分別加入20 μl的CD34-FITC、CD11b-FITC、CD90-PE及CD105-PE單克隆抗體，另設(shè)3管分別用同型對照單克隆抗體確定背景標記，室溫避光放置30 min。以PBS洗去未標記抗體，離心后細胞加入含1%多聚甲醛的PBS固定。用流式細胞術(shù)檢測，用配套的Cell Quest軟件計算細胞表面抗原陽性率。

1.3.3 細胞周期測定 取第3代生長狀態(tài)良好的MSC，消化離心后收集，計數(shù)達1×106/ml，去除細胞碎片。加入1 ml預(yù)冷的70%乙醇，吹打均勻，封口，4℃固定24 h。檢測前離心去除固定液，加入10 mg/ml的RNase 20 μl，37℃水浴30 min，PBS洗滌l次，離心去上清，加入50 μg/ml的PI 1 ml，4℃避光染色30 min，300目濾網(wǎng)過濾后用流式細胞術(shù)檢測，進行細胞周期分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué) 剛接種的MSC大多呈圓形，單核;培養(yǎng)24 h后，部分細胞貼壁伸展，并開始聚集成細胞集落;48 h時貼壁細胞顯著增多，以橢圓形為主，部分細胞呈短梭形;4 d后成纖維細胞樣集落形成(CFU-F)，由10～30個細胞組成，細胞形態(tài)為長梭形或多角形;11 d后細胞集落間相互融合成單層，長滿整個培養(yǎng)瓶，細胞排列呈平行狀或漩渦狀。傳代培養(yǎng)的細胞生長速度較原代培養(yǎng)明顯增快，不再形成細胞集落，7～8 d即可鋪滿瓶底。

2.2 細胞生長曲線 P1、P3、P5細胞生長曲線均呈S形(見圖1)，具有以下共同特征:細胞潛伏期為1～2 d，從第3天細胞大量增殖進入對數(shù)生長期，第6天達到高峰期，以后進入平臺期。P5細胞第3天起其生長速度低于P1、P3細胞，但P＞0.05。

圖1 P1、P3、P5 MSC生長曲線

2.4 細胞周期 P3 MSC中，處于G0/G1期細胞約占77.42%，處于S+G2/M期細胞約占22.58%。大部分細胞處于相對不活躍的靜止期，只有小部分處于活躍的增殖狀態(tài)，符合干細胞的特性。

3 討論

MSC因其廣闊的應(yīng)用前景而成為目前關(guān)注熱點［5］。高純度MSC的獲取是間充質(zhì)干細胞研究的理想基礎(chǔ)條件。目前從骨髓中分離培養(yǎng)MSC的方法主要有貼壁篩選法［6］、密度梯度離心法［1］和免疫法［7］。傳統(tǒng)的貼壁篩選法操作簡單，價格低廉，但所得細胞純度不高。密度梯度離心法操作較復(fù)雜，且分離時會丟失一定數(shù)量的MSC而不能有效達到較高的分離率，但所得細胞純度比貼壁法高。免疫法主要有流式細胞儀分離和免疫磁珠分選技術(shù)，分離獲得的MSC純度最高，但實驗條件要求高，需要骨髓量大。本實驗用Percoll分離液對全骨髓做梯度離心，去除絕大部分紅細胞、粒細胞、脂肪細胞和血小板，獲得純度較高的單個核細胞，再根據(jù)其貼壁性差異，換液棄除懸浮生長的造血細胞，獲得純度較高、增殖能力較強、生長性狀穩(wěn)定的MSC。

MSC雖然是一群均質(zhì)細胞，但兼具有間質(zhì)細胞、上皮細胞和內(nèi)皮細胞的特點，缺乏特異性的識別標志［8］，且同發(fā)育階段的MSC表面標志也可能存在差異。一般認為［1，9］整合素家族成員的CD29、黏附分子CD44、CD166及CD90、CD105等是MSC保持未分化狀態(tài)時重要的表面標志，不表達造血細胞的標志性抗原是CD11、CD14、CD34及CD45。由于MSC無特異性的表面標志物，因此其準確鑒定較為困難。目前主要通過以下幾個方面鑒定MSC［10］:①體外培養(yǎng)貼壁生長呈梭形;②用特異結(jié)合MSC細胞膜抗原的單克隆抗體直接鑒定;③能夠自主增殖至少可以分化為3種以上間充質(zhì)細胞系。本實驗所培養(yǎng)的細胞由人骨髓取材，呈成纖維細胞樣貼壁生長，培養(yǎng)至第3代時即可發(fā)現(xiàn)細胞可高表達CD90、CD105，而不表達CD34、CD11b，表明所分離培養(yǎng)的細胞是來源于骨髓、均一的MSC。

細胞生長曲線是觀察細胞生長基本規(guī)律的重要方法。本實驗對P1、P3、P5的MSC繪制生長曲線，發(fā)現(xiàn)MSC生長同樣經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期，5代以內(nèi)MSC增殖旺盛、具有較好的細胞活力，適合進行實驗研究和臨床應(yīng)用。細胞周期分析顯示，絕大部分細胞處于G0/G1期，少部分處于S+ G2/M期，與文獻報道一致［9］，說明絕大部分細胞處于靜止態(tài)，但保留自我更新和增殖能力，少部分處于功能態(tài)，符合干細胞的生長特性。

總之，密度梯度離心結(jié)合貼壁篩選法分離獲得的人MSC純度高(99%)，且該方法較簡單、有效，因此是分離純化人MSC的較好方法。

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