質(zhì)譜在生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用

彭 翱 ,趙 芊 ,江 驥 ,胡 蓓

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心,北京 100730)

質(zhì)譜在生物標(biāo)志物研究中的應(yīng)用

彭 翱 ,趙 芊 ,江 驥 ,胡 蓓

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心,北京 100730)

生物標(biāo)志物是一個(gè)指示劑,可以對(duì)其進(jìn)行測(cè)定并用以解釋正常生理過程、病理過程及治療藥物的藥理學(xué)效應(yīng),廣泛的應(yīng)用于藥物研發(fā)和臨床診斷中。生物標(biāo)志物的研究涉及多種技術(shù)平臺(tái)和方法,其中基于質(zhì)譜的研究方法無論在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)還是確證過程中都有著廣泛的應(yīng)用。本文討論了基于質(zhì)譜的研究方法在通常的生物標(biāo)志物以及阿爾茨海默氏癥研究中的進(jìn)展。

質(zhì)譜;生物標(biāo)志物;阿爾茨海默氏癥

在過去的10年中,人們對(duì)人類疾病的分子基礎(chǔ)有了深入的認(rèn)識(shí),同時(shí)也增加了對(duì)治愈致死性疾病(如癌癥)的期望。然而,隨著對(duì)疾病認(rèn)識(shí)的增加,新藥研發(fā)的復(fù)雜性和費(fèi)用呈指數(shù)型增加,導(dǎo)致藥政管理部門批準(zhǔn)新化合物實(shí)體的停滯。在這種情況下,美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)發(fā)表的“路線圖”和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)頒布的“啟動(dòng)關(guān)鍵之路”已經(jīng)指出:“生物標(biāo)志物”是目前這種危機(jī)的潛在“救星”之一。

生物標(biāo)志物有這樣一種特征,它作為一個(gè)指示劑,可以對(duì)其進(jìn)行測(cè)定并用以解釋正常生理過程、病理過程及治療藥物的藥理學(xué)效應(yīng)[1]。因?yàn)樯飿?biāo)志物可以更可靠、更早期的預(yù)測(cè)疾病,增加治療藥物對(duì)特定目標(biāo)人群的選擇性,并允許實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),甚至預(yù)測(cè)治療的療效。對(duì)于耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用高的藥物研發(fā)過程來說,生物標(biāo)志物被認(rèn)為可用于做出繼續(xù)或終止研發(fā)的決策。今后,生物標(biāo)志物的應(yīng)用會(huì)為個(gè)體化治療的開展鋪平道路,盡早確定治療的獲益/風(fēng)險(xiǎn)比,以便更好的保護(hù)患者免于不當(dāng)?shù)闹委煛?/p>

1 生物標(biāo)志物的研究方法

生物標(biāo)志物的研究工作包括發(fā)現(xiàn)階段和驗(yàn)證階段。當(dāng)一個(gè)生物標(biāo)志物順利通過確證后,便可以在臨床工作中應(yīng)用。在傳統(tǒng)的研究模式中,生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)工作是在基于質(zhì)譜的技術(shù)平臺(tái)上進(jìn)行的,而驗(yàn)證及臨床應(yīng)用工作會(huì)采用基于配體分析(LBA)的研究技術(shù),如酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。這種研究模式在研究效率上顯然并不是很成功,因?yàn)樗谘芯康牟煌A段需要涉及到2種或2種以上的,且相互獨(dú)立的分析方法學(xué)。此外,受到關(guān)注的是在一些臨床情況下,同時(shí)應(yīng)用多個(gè)生物標(biāo)志物具有更好的特異性,對(duì)疾病的診斷更加準(zhǔn)確[2-5]。這意味著,如果使用配體分析方法,診斷程序?qū)⒆兊酶訌?fù)雜,給患者帶來更大的經(jīng)濟(jì)壓力。基于以上原因,將生物標(biāo)志物的研究工作整合在一種技術(shù)平臺(tái)上,既避免了分析方法的多重開發(fā),也更適于臨床應(yīng)用。在眾多的分析方法中,質(zhì)譜技術(shù)無疑是理想的候選之一,然而同樣面臨著相應(yīng)的挑戰(zhàn)。首先,生物標(biāo)志物的血清濃度動(dòng)態(tài)范圍很寬,例如高豐度的白蛋白和一些經(jīng)典的生物標(biāo)志物前列腺特異抗原(PSA)的濃度可相差108～1 010倍,如果要對(duì)這些低豐度蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度都符合要求的定量,樣本酶解前的預(yù)分離是非常重要的。樣本預(yù)分離通常采用液相色譜完成,使用反向及親和兩種不同原理的色譜技術(shù)去除不相關(guān)的高豐度蛋白,保證豐度低的潛在生物標(biāo)志物的測(cè)定不受影響。另一種挑戰(zhàn)來自對(duì)翻譯后修飾(PTM)的特殊蛋白的定量分析,主要解決方法包括:親和吸附、對(duì)目標(biāo)病變組織分析,穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(ICAT,iTRAQ)。生物標(biāo)志物研究的不同階段的質(zhì)譜方法和技術(shù)列于表1。

表1 生物標(biāo)志物研究的主要階段以及涉及到的質(zhì)譜方法和技術(shù)Table 1 The biomarker development pathw ay,indicating the nature of the analysis in the three phases of discovery,validation and clinical application

生物標(biāo)志物的確證對(duì)獲得合格的生物標(biāo)志物以及將其成功應(yīng)用到臨床工作中是至關(guān)重要的。在歐洲,所有收集受試者標(biāo)本進(jìn)行生物標(biāo)志物測(cè)定的臨床試驗(yàn)都必須報(bào)告管理當(dāng)局,實(shí)驗(yàn)室的測(cè)定過程被要求依從全面的質(zhì)量控制。為落實(shí)當(dāng)局的要求,生物標(biāo)志物的分析不得不經(jīng)歷全面的方法學(xué)考核。美國(guó)藥學(xué)科學(xué)家協(xié)會(huì)(AAPS)和美國(guó)臨床配體分析協(xié)會(huì)(CLAS)將生物標(biāo)志物的分析方法分為以下4類[6-8]:1)絕對(duì)定量分析使用標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸模型來計(jì)算未知樣本中的絕對(duì)定量值,其中標(biāo)準(zhǔn)品能夠完全體現(xiàn)和代表生物標(biāo)志物;2)使用響應(yīng)-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行相對(duì)定量分析,但標(biāo)準(zhǔn)品不能完全代表生物標(biāo)志物;3)半定量分析中不采用標(biāo)準(zhǔn)曲線,但是待測(cè)樣本能夠以連續(xù)響應(yīng)結(jié)果進(jìn)行表達(dá);4)定性分析可以是定序結(jié)果(ordinal data),如免疫組化,或者是適用于判斷是/否的定類結(jié)果(nominal data)。不同生物標(biāo)志物分析需要對(duì)不同的指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證,目前對(duì)不同類型的生物標(biāo)志物分析所需要的考核內(nèi)容列于表2。在生物標(biāo)志物的方法學(xué)考核中,有兩種基本生物分析指導(dǎo)原則可以參考:其一是FDA頒布的適用于藥物生物分析的指導(dǎo)原則;另一個(gè)是美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)和臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法案(CLIA)頒布的適用于臨床診斷分析的指導(dǎo)原則。此外,Lee等[6-8]對(duì)生物標(biāo)志物分析的方法學(xué)驗(yàn)證也進(jìn)行了全面的總結(jié)。

近年來,質(zhì)譜技術(shù)在靈敏度、特異性、研究方法和通量方面的優(yōu)勢(shì),使其廣泛的應(yīng)用到生物標(biāo)志物的研究中。

表2 生物標(biāo)志物的分析類型及考核內(nèi)容Table 2 V alidation characteristics of various assay proformance categories of assay

2 阿爾茨海默氏癥中生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展

過去的25年中,對(duì)阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s disease,AD)的基礎(chǔ)以及臨床研究使我們對(duì)這種疾病的分子機(jī)理和臨床病理有了詳細(xì)的認(rèn)識(shí)。阿爾茨海默氏癥是一種復(fù)雜的持續(xù)性過程,相互影響的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)相繼出現(xiàn),其中包括β-淀粉樣肽(Aβ)的聚集與斑塊發(fā)展的相互影響,以及τ蛋白的過磷酸化和聚集與纏結(jié)形成的相互作用。連同其他的病理過程,如炎癥和氧化應(yīng)激,這種病理級(jí)聯(lián)過程最終導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)的丟失,以及進(jìn)行性的神經(jīng)退行性病變。隨著該領(lǐng)域研究的進(jìn)展,部分研究結(jié)果已經(jīng)進(jìn)入候選藥物的研究階段,其中大部分已經(jīng)進(jìn)入2期臨床試驗(yàn)研究,均為緩解疾病癥狀的藥物。從轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究結(jié)果可以看出,這一類緩解疾病的新藥在Aβ聚集過程的早期更加有效,而在嚴(yán)重斑塊形成和神經(jīng)退行性病變的晚期則療效較差。但是,目前用于鑒別阿爾茨海默氏癥患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)僅能診斷出神經(jīng)病理處于晚期的患者,因此需要提升對(duì)疾病早期發(fā)現(xiàn)的能力。如果能夠早期發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行1年的干預(yù)癡呆性治療,預(yù)計(jì)到2050年阿爾茨海默氏癥的患病率會(huì)從8 000萬降至900萬。

阿爾茨海默氏癥的生物標(biāo)志物可以分為兩類:首先是核心生物標(biāo)志物,它能夠反映疾病的基本發(fā)病特征,例如淀粉樣前體蛋白(APP)和Aβ的非正常代謝;其次是下游生物標(biāo)志物,它能夠反應(yīng)下游的病理現(xiàn)象,例如軸突變性。目前主要以腦脊液(CSF)為阿爾茨海默氏癥生物標(biāo)志物的研究對(duì)象,腦脊液生物標(biāo)記物能夠反映大腦神經(jīng)化學(xué)的變化,并且可以通過腰椎穿刺獲得樣本,且無明顯的副作用。相對(duì)于腦脊液生物標(biāo)記物,很少能成功的在外周血液中尋找到生物標(biāo)志物。事實(shí)上,許多已發(fā)表的血液生物標(biāo)志物,在接下來的研究中被證實(shí)其診斷價(jià)值不高。血漿中的Aβ40和Aβ42雖然可以被測(cè)定,但是外周Aβ水平并不能反映大腦中Aβ的變化。

在大量研究中得到確證的腦脊液生物標(biāo)志物包括:Aβ40,Aβ42,總τ蛋白和磷酸化τ蛋白。其中,Aβ40,Aβ42和磷酸化τ蛋白能作為核心標(biāo)志物反映阿爾茨海默氏癥疾病過程大腦的淀粉樣病變以及皮質(zhì)神經(jīng)纖維纏結(jié);相反,總τ蛋白是反應(yīng)軸突損傷的非特異性標(biāo)志物,它能夠反映神經(jīng)變性的過程。在對(duì)阿爾茨海默氏癥不同階段患者的生物標(biāo)志物研究中,腦脊液中總τ蛋白和磷酸化τ蛋白水平升高,以及 Aβ42或Aβ42/Aβ40降低的綜合評(píng)價(jià)是較為可靠的生物標(biāo)志物,這種綜合評(píng)價(jià)的靈敏度大于95%,特異性大于85%。采用腦脊液生物標(biāo)志物的綜合診斷已經(jīng)在3個(gè)多中心研究中得以驗(yàn)證。此外,還有大量的潛在生物標(biāo)志物能夠反映阿爾茨海默氏癥原發(fā)和繼發(fā)的病理改變。其中,反映病理進(jìn)程的標(biāo)志物包括β位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白清除酶1(BACE1)活性和濃度,Aβ降解產(chǎn)物;反映次要事件的標(biāo)志物包括氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥等,對(duì)這些標(biāo)志物潛在診斷價(jià)值的研究相對(duì)較少。但是,BACE1活性以及APP異構(gòu)體對(duì)某些候選藥物的生化作用給了重要的信息,例如BACE1抑制劑。

鑒于Aβ在阿爾茨海默氏癥淀粉樣病變級(jí)聯(lián)學(xué)說中的中心地位,定量研究在生物標(biāo)志物確證中有著重要的意義。Aβ容易自我聚集,或結(jié)合于其他蛋白或玻璃表面,使得 ELISA分析變得相對(duì)困難。此外,Aβ可能經(jīng)過翻譯后修飾以及與腦脊液中內(nèi)源組分產(chǎn)生交叉反應(yīng)使ELISA分析變得復(fù)雜。同樣,LC/MS法也存在挑戰(zhàn),Aβ的疏水性強(qiáng),容易吸附在樣本管、進(jìn)樣器以及色譜柱上,這對(duì)質(zhì)譜分析造成了很大影響。但通過對(duì)液相條件進(jìn)行優(yōu)化可以改善Aβ聚集的問題,如在反向系統(tǒng)結(jié)合堿性洗脫條件下,Aβ的保留行為和回收率可以得到明顯提高[9-10]。

通過選擇特定的質(zhì)譜分析器以及相應(yīng)的掃描模式可以提高對(duì)Aβ的分析能力。通常,串聯(lián)質(zhì)譜是分析復(fù)雜多肽混合物的有效方法,相同質(zhì)量分析器的串聯(lián)質(zhì)譜包括三重四極桿(QQQ)、3D離子阱(3D ion traps)、線性離子阱(linear ion traps)和串聯(lián)飛行時(shí)間(TOF-TOFs);結(jié)合不同質(zhì)量分析器的串聯(lián)質(zhì)譜在Aβ的分析中具有更好的能力和表現(xiàn),其中包括四極桿-時(shí)間飛行(Q-TOF)、四極桿-線性離子阱(Q-ion trap)和線性離子阱-傅里葉轉(zhuǎn)換離子回旋共振(L TQFTICR)。而采用L TQ的全掃描方式是Aβ定量分析的理想選擇。采用這種分析方法,數(shù)據(jù)處理靈活,且可獲得肽段離子的精確質(zhì)量數(shù)[11-12]。針對(duì)Aβ42和Aβ40的特異性可以選擇 Q-L TQ串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng),掃描模式采用子離子掃描(PI),而非選擇離子掃描(SIM)[10]。在該類研究中,選擇離子掃描無法滿足特異性的要求,因?yàn)樯锘|(zhì)中可能存在與Aβ具有相同質(zhì)荷比的內(nèi)源性干擾。而通過選擇特定的母子離子對(duì)能夠提供更高的特異性。此外,串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)也可以用于多肽的質(zhì)譜分析,但是,Q-L TQ質(zhì)譜的增強(qiáng)子離子掃描(EPI)能夠提供更高的靈敏度。另外,由于某些酶的化學(xué)修飾作用,Aβ的定量分析可能變得非常復(fù)雜,出現(xiàn)無法解釋的Aβ種類[12],導(dǎo)致對(duì)Aβ影響的錯(cuò)誤估計(jì)[13]。傳統(tǒng)的MALDI/MS分析使用溶劑會(huì)導(dǎo)致對(duì)Aβ42中親水部分的過高響應(yīng),而兩性部分無質(zhì)譜響應(yīng)。隨著MALDI技術(shù)的發(fā)展,可以不使用溶劑,這樣過高響應(yīng)和過低響應(yīng)均會(huì)降低,不會(huì)給Aβ的測(cè)定帶來明顯影響[14]。在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下,固相分析是蛋白質(zhì)分析的有力工具,而MALDI相對(duì)于 ESI的優(yōu)勢(shì)是其電離是靜態(tài)的,這樣使其能夠輕易地應(yīng)用到微陣列的分析中。此外,無論化合物相對(duì)分子質(zhì)量的大小,MALDI能夠提供單電荷分子離子,這使得質(zhì)譜解析變得簡(jiǎn)單。

3 結(jié)論

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展,其在應(yīng)用的靈活性、研究通量、準(zhǔn)確度和靈敏度都具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在生物標(biāo)志物的研究過程中,對(duì)潛在生物標(biāo)志物的確證是非常重要的,嚴(yán)格和認(rèn)真的生物標(biāo)志物確證工作是應(yīng)用質(zhì)譜進(jìn)行生物標(biāo)志物研究的關(guān)鍵。同時(shí),只有良好的整合科研與臨床工作,生物標(biāo)志物的研究才會(huì)取得成功。

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Mass Spectrometry in Biomarker Investigation

PENG Ao,ZHAO Qian,J IANGJi,HU Pei
(Clinical Pharmacology Research Center,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing100730,China)

A biomarker is a characteristic,which is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes,pathogenic processes or phar macologic responses to a therapeutic agent.They were increasingly used in drug development and clinical diagnostics.There were several platforms and methods used in biomarker investigation,and the mass-based methods had their contribution from the discovery stage to the qualification stage of biomarker investigation.In this review,we discussed the mass-based methods in general biomarker investigation and Alzheimer’s disease.

mass spectrometry;biomarker;Alzheimer’s disease

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0031-05

2010-12-08;

2011-01-17

彭 翱(1979～),男(漢族),湖南人,博士,臨床藥理學(xué)專業(yè)。E-mail:mailpeng@yahoo.com.cn

胡 蓓(1956～),女(漢族),四川人,教授,博士生導(dǎo)師,臨床藥理學(xué)專業(yè)。E-mail:pei.hu.pumc@gmail.com