利用QqQ-MS碰撞能量自動優(yōu)化功能確定磷脂脂肪?；恢?/h1>
2011-02-02 07:01:18蘇小玲徐繼林陳娟娟嚴(yán)小軍
質(zhì)譜學(xué)報 2011年4期
蘇小玲,徐繼林,陳娟娟,趙 鵬,嚴(yán)小軍
(寧波大學(xué),應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)
利用QqQ-MS碰撞能量自動優(yōu)化功能確定磷脂脂肪?；恢?/p>
蘇小玲,徐繼林,陳娟娟,趙 鵬,嚴(yán)小軍
(寧波大學(xué),應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)
利用三重四極桿質(zhì)譜碰撞能量自動優(yōu)化功能,在正、負(fù)離子檢測模式下,對磷脂標(biāo)準(zhǔn)品(包括 PA,PC,PE,PS,PG,PI)不同碰撞能量下子離子的裂解規(guī)律進(jìn)行研究。實驗發(fā)現(xiàn):在負(fù)離子模式下,各類磷脂的子離子[M-H-R2COOH]-強度總是高于[M-H-R1COOH]-強度,而[M-H-R’2CH=CO]-豐度總是高于[M-H-R’1CH=CO]-豐度,這個規(guī)律可以用于確定左右磷脂的?；恢谩Ａ硗?在負(fù)離子模式下,PA和PS母離子裂解產(chǎn)生的羧酸陰離子豐度比均為R1COO-高于R2COO-,PC則為R1COO-低于R2COO-;在正離子模式下,PS裂解產(chǎn)生的?；栯x子R1CO+豐度總是低于R2CO+,PA和PC在低碰撞能量下,sn-1脂肪?；鶊F(tuán)作為烯酮的中性丟失而產(chǎn)生離子豐度總是低于sn-2位上產(chǎn)生的對應(yīng)離子;而PE和PG的sn-1位脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸的中性丟失而產(chǎn)生的離子在低碰撞能量下的豐度高于sn-2位上產(chǎn)生的離子。這些規(guī)律可用于輔助確定磷脂脂肪?；奈恢谩?/p>
三重四極桿質(zhì)譜;磷脂;脂肪?；恢?/p>
天然磷脂是含磷酸的類脂化合物,它除了構(gòu)成生物膜外,還參與細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)功能[1],同時,在影響植物光合作用效率[2-3]等方面也發(fā)揮著重要作用。磷脂的基本結(jié)構(gòu)示于圖1。同一類磷脂之間的差別體現(xiàn)在?；舅峤M成和位置的不同,而確定磷脂不同位置的脂肪?；M成對研究生物體磷脂的合成途徑有著重要的意義[4]。
圖1 磷脂的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 The general structure of glycerophospholipids
目前,多采用三重四極桿質(zhì)譜(QqQ-MS)或線性離子阱質(zhì)譜(L IT-M S)研究磷脂脂肪?；牧呀庖?guī)律[5-10],但均是取某一特定碰撞能量研究磷脂的裂解情況,而并未將整個碰撞能量范圍進(jìn)行全面的考慮。Hvattuma等[11]研究發(fā)現(xiàn),18:0/20:4 PE在低碰撞能量下更有利于 sn-2的丟失,而在高能量下,sn-1則更易丟失。這說明某些磷脂在不同碰撞能量下其子離子的相對豐度會發(fā)生變化。三重四極桿質(zhì)譜碰撞能量自動優(yōu)化功能可以直觀給出同一母離子的不同子離子豐度與碰撞能量的變化曲線,從而根據(jù)各離子相對豐度的變化來研究磷脂分子中不同?；奈恢谩?/p>
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
TSQ Quantum Access三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng):美國 Thermo Fisher公司產(chǎn)品;超純水系統(tǒng):美國M illipore公司產(chǎn)品。
磷脂酸(PA)、卵磷脂(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)標(biāo)準(zhǔn)品:美國Avanti Polar Lipids公司產(chǎn)品;甲酸(色譜純):美國 Sigma-A ldrich公司產(chǎn)品;其他試劑(色譜純):美國 Tedia公司產(chǎn)品;純水由超純水系統(tǒng)制備。
1.2 實驗方法
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取各標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇稀釋至 1 g/L,再用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸銨)=300∶665∶35的溶液進(jìn)一步稀釋至10 mg/L,直接進(jìn)樣上機分析。
1.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離(ESI)源正、負(fù)離子電離模式,噴霧電壓2 800 V,鞘氣流量12 L/m in,輔助氣流量 4 L/m in,離子傳輸毛細(xì)管溫度350℃,選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式,碰撞室能量采用5～80 V進(jìn)行掃描。正離子模式下蠕動泵流速10μL/m in;負(fù)離子模式下蠕動泵流速 8μL/min。碰撞氣為氬氣,碰撞氣壓力23.79 Pa。
2 結(jié)果與討論
2.1 負(fù)離子模式下各磷脂分子裂解規(guī)律
磷脂骨架是甘油骨架,其中sn-1和sn-2位兩個羥基通過酯鍵分別連接兩個脂肪酸鏈,另一羥基連接極性頭部。ESI源負(fù)離子模式下,磷脂多以[M-H]-離子存在,對其做二級質(zhì)譜分析,在5～80 V范圍內(nèi)改變碰撞能量,觀察得到的子離子形式包括sn-1羧酸陰離子(R1COO-),sn-2羧酸陰離子(R2COO-),也會形成對應(yīng)于 sn-1和sn-2位脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸和烯酮的中性丟失而產(chǎn)生的離子[M-H-RXCOOH]-和[M-H-R’XCH=CO]-(RX=RX’CH2)。
選擇得到的子離子作為研究對象,利用三重四極桿質(zhì)譜碰撞能量自動優(yōu)化的功能,對產(chǎn)生相應(yīng)子離子的碰撞能量進(jìn)行自動優(yōu)化,儀器可以自動給出各子離子豐度隨著碰撞能量改變而變化的曲線,示于圖2。
2.1.1 羧酸陰離子(RXCOO-)的裂解規(guī)律以PA為例,圖2是 16∶0/18∶1 PA的m/z673([M-H]-)母離子產(chǎn)生子離子時,碰撞能量自動優(yōu)化后各子離子豐度隨著碰撞能量變化而變化的曲線。從圖中可以看出,在碰撞能量變化的整個范圍內(nèi),處在sn-1位的脂肪?；鶊F(tuán)形成的m/z255負(fù)離子(R1COO-)的豐度總是大于處在sn-2位的脂肪酰基基團(tuán)形成的m/z281(R2COO-)(圖2a),此規(guī)律在 18∶0/22∶6 PA的m/z747([M-H]-)母離子產(chǎn)生的相應(yīng)子離子變化中同樣出現(xiàn)?？梢娫诒緦嶒炛?無論是16∶0/18∶1 PA 還是 18∶0/22∶6 PA,都是sn-1位更容易斷裂,在對應(yīng)變化圖上位于上方的曲線代表的?；鶊F(tuán)就位于sn-1,位于下方的曲線代表的?；鶊F(tuán)就位于 sn-2位。Hsu等[5]利用 ESI源QqQ-M S在低碰撞能量下研究了 PA的裂解規(guī)律,發(fā)現(xiàn) 16∶0/18∶1、18∶0/20∶4 PA子離子豐度比為 R1COO-＞R2COO-。因此可以認(rèn)為,PA的子離子豐度R1COO-總是大于R2COO-。
圖2 16∶0/18∶1 PA[M-H]-離子所產(chǎn)生的不同子離子在不同碰撞能量下的相對豐度Fig.2 The relative intensity of product ion arising from the dissociation of[M-H]-ion of C16∶0/18∶1 PA at different collision energies
對于其他磷脂而言,由于極性頭部的不同,各子離子豐度隨著碰撞能量變化的規(guī)律并不一致。Vensen[12]利用快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-M S)研究PC負(fù)離子模式時的裂解情況,發(fā)現(xiàn)sn-2位羧酸陰離子的相對豐度大約是sn-1位的2倍;而 Hsu等[6]利用多級串聯(lián)離子阱質(zhì)譜詳細(xì)研究正負(fù)離子模式下的 PS裂解,發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下R1COO-的豐度高于 R2COO-。他們均是取某一特定碰撞能量研究磷脂的裂解情況,而并未將整個碰撞能量范圍進(jìn)行全面考慮。本實驗另外選取 2種 PA、PC、PS、PE、PG、PI,觀察其在不同碰撞能量下羧酸陰離子的相對豐度,結(jié)果列于表1。由表1可知,與 PA類似,PS sn-1位的羧酸陰離子豐度也總是高于sn-2位,即 R1COO-＞R2COO-。Hvattuma等[11]研究了 18∶0/20∶4 PS、PA,也得到了相同的規(guī)律,這證實了本實驗結(jié)果的正確性。而對于PC而言,無論是14∶0/18∶1還是 18∶1/14∶0,結(jié)果均顯示R2COO-＞R1COO-。Han等[13]研究了碰撞能量為18～25 V PC(16∶0/18∶1、16∶0/18∶2、18∶0/18∶1、16∶0/20∶4),發(fā)現(xiàn) sn-2位產(chǎn)生的羧酸陰離子是sn-1位的3倍,這與本實驗得到的結(jié)果一致。
這種具有同樣?；庪x子相對豐度大小的規(guī)律并非存在于所有磷脂裂解過程中。有報道指出,磷脂分子甘油骨架上?；湹奈恢脤Ψ肿与x子解離影響較大,sn-1與sn-2裂解豐度比值取決于sn-2位上酰基鏈的長短及不飽和鍵的數(shù)目[13]。本實驗中,PE、PG、PI在負(fù)離子模式下羧酸陰離子未發(fā)現(xiàn)一致的規(guī)律。例如 PG,16∶0/18∶1 PG在不同的碰撞能量下,R2COO-曲線始終高于 R1COO-曲線;而對于18∶0/22∶6 PG而言,當(dāng)碰撞能量在5～30 V時,sn-1位?；x子豐度與sn-2位幾乎一樣,當(dāng)能量提高時,R1COO-豐度高于R2COO-豐度,示于圖3,所以無法用這兩個離子的相對豐度變化來定性這些磷脂的?；恢?。
表1 各類磷脂標(biāo)準(zhǔn)品在5～80 V碰撞能量下,sn-1和sn-2位羧酸陰離子的相對豐度比Table 1 The relative abundance ratio of carboxylate anion from sn-1 or sn-2 from 6 classes of phospholipids under different collision energies(5～80 V)
2.1.2 負(fù)離子模式下[M-H-R’XCH=CO]-,[M-H-RXCOOH]-的裂解規(guī)律 仍以PA為例,進(jìn)一步觀察16∶0/18∶1 PA的m/z673([M-H]-)母離子產(chǎn)生的其他子離子可見,子離子m/z391[M-H-R2COOH]-的豐度在各碰撞能量下總是高于m/z417[MH-R1COOH]-;而子離子m/z409[M-HR’2CH=CO]-的豐度始終高于m/z435[MH-R’1CH=CO]-,這些結(jié)果說明 ,16∶0/18∶1 PA的sn-2位比sn-1位更有利于脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸和烯酮的中性丟失。
從表1可見,PE、PG、PI各羧酸陰離子的豐度之間沒有類似 PA、PC、PS所具有的共同規(guī)律。為了確認(rèn)PA、PC、PS其他子離子是否也具有一致的裂解規(guī)律,進(jìn)一步考察了其他子離子之間的豐度變化。選擇對比[M-H-R’XCH=CO]-、[M-H-RXCOOH]-相對離子豐度發(fā)現(xiàn),隨著碰撞能量的增加,所有標(biāo)準(zhǔn)脂[M-HR1COOH]-豐度總是小于[M -HR2COOH]-,同時 ,[M-H-R’1CH=CO]-豐度也總是小于[M-H-R’2H=CO]-。Hsu等[7-10]在某一能量下對 PE 18∶0/16∶0,PG 18∶1/16∶0、18∶0/20∶4,PI的研究也得到了同樣的結(jié)論。故這6種磷脂分子均可根據(jù)[MH-R’XCH=CO]-或[M-H-RXCOOH]-(PC根據(jù)[M-H-CH3-R’XCH=CO]-或[M-H-CH3-RXCOOH]-,PS根據(jù)[M-H-87-R’XCH=CO]-或 [M-H-87-RXCOOH]-,且X=1,2)豐度直接確定酰基所在的位置。但是由于羧酸陰離子的豐度都高于其他子離子的豐度(例如 PA),所以對于PA、PC、PS 來說 ,用 R1COO-和 R2COO-豐度比確定?；谖恢酶啽恪⒅庇^。
2.2 正離子模式下各磷脂分子裂解規(guī)律
2.2.1 PA ESI源正離子模式下,PA多以[M+H]+離子存在,同時,PA易發(fā)生中性丟失極性頭部(H3PO4)而產(chǎn)生[M+H-98]+子離子。以 16∶0/18∶1 PA為例,對[M+H-98]+做二級質(zhì)譜,觀察所產(chǎn)生的碎片離子,發(fā)現(xiàn)包含裂解產(chǎn)生的m/z339[M+H-98-R’1CH=CO]+、m/z313[M+H-98-R’2H=CO]+。另外,PA[M+H-98]+做二級質(zhì)譜碎裂得到?；栯x子分別為m/z239 R1CO+和m/z265 R2CO+。
比較上述觀察所得到的子離子相對豐度,發(fā)現(xiàn)m/z239的相對豐度低于m/z265,但在整個碰撞能量范圍內(nèi),二者的豐度比較接近;在低碰撞能量(＜30 V)下,m/z339相對豐度明顯低于m/z313,在碰撞能量30～45 V下,m/z339的豐度則高于m/z313。對18∶0/22∶6 PAm/z651[M+H-98]+做二級質(zhì)譜,觀察到m/z267(R1CO+)豐度明顯高于m/z311(R2CO+)。當(dāng)碰撞能量小于50 V時,m/z385[M+H-98-R’1CH=CO]+豐度明顯低于m/z341[M+H-98-R’2H=CO]+;當(dāng)碰撞能量高于45 V時,二者的豐度均很低。對于m/z367[M+H-98-R1COOH]+和m/z323[M+H-98-R2COOH]+而言,在能量小于40 V時,m/z367明顯高于m/z323。據(jù)此,在低碰撞能量下可以根據(jù)[M+H-98-R’1CH=CO]+和[M+H-98-R’2H=CO]+的相對離子強度確定 PA?；幍奈恢谩?/p>
2.2.2 PC 14∶0/18∶1 PC和18∶1/14∶0 PC在正離子模式下不僅可以產(chǎn)生[M+H]+離子,還可以產(chǎn)生[M+Na]+,但[M+Na]+信號強度較低,故選擇[M+H]+離子做二級質(zhì)譜。對兩種PC酰基陽離子做碰撞能量自動優(yōu)化,得到的信號強度均很低,不利于做比較。在本實驗中,發(fā)現(xiàn)sn-2位比sn-1位更有利于脂肪酸酰基基團(tuán)丟失,這體現(xiàn)在碰撞能量小于50 V時,[M+H-R’2H=CO]+的相對豐度高于[M+H-R’1H=CO]+(能量大于 50 V時,[M+H-R’XH=CO]+信號強度很低,接近于 0)。Hsu等[6]利用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜研究了16∶0/18∶1 PC,同樣發(fā)現(xiàn)了正離子模式下[M+HR’2H=CO]+的相對豐度總是高于[M+HR’1H=CO]+。所以,對于 PC而言,正離子模式下脂肪酰基在甘油骨架的位置可通過此規(guī)律來確定。
2.2.3 PE PE易中性丟失C2H8O4NP(141 u)形成[M+H-141]+離子 ,故 16∶0/18∶1 PE和18∶0/22∶6 PE的母離子m/z718[M+H]+和m/z792[M+H]+在正離子模式的主要子離子是m/z577和m/z651。觀察 16∶0/18∶1 PE的其他子離子,發(fā)現(xiàn)R1CO+豐度明顯低于R2CO+;[M+H-141-R1COOH]+的離子豐度在碰撞能量小于35 V時總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度,高碰撞能量下二者得到的信號均很低;另外,能量小于30 V時,m/z339[M+H-141-R’1H=CO]+的強度高于m/z313[M+H-141-R’2H=CO]+,能量大于30 V時,m/z339低于m/z313,示于圖4。觀察18∶0/22∶6 PE則發(fā)現(xiàn),R1CO+豐度總是高于R2CO+,[M+H-141-R1COOH]+的離子豐度總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度 ,[M+H-141-R’1H=CO]+的強度低于[M+H-141-R’2H=CO]+。仔細(xì)分析上述規(guī)律,可發(fā)現(xiàn)共有規(guī)律為PE所產(chǎn)生的子離子[M+H-141-R1COOH]+豐度在低碰撞能量下總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度,因此,可以直接確定出PE?；幍奈恢谩?/p>
圖4 16∶0/18∶1 PE子離子[M-140-R1 COOH]+和[M-140-R2 COOH]+的相對離子強度Fig.4 The relative intensity of the[M-140-R1COOH]+and the[M-140-R2 COOH]+from C16∶0/18∶1 species of PGat different collision energies
2.2.4 PG PG在正離子模式下極易丟失包括磷酸在內(nèi)的極性頭部基團(tuán)而形成特征離子[M-171]+。另外,16∶0/18∶1 PG[M+H]+離子強度很低,故選擇[M-171]+做二級質(zhì)譜,分別觀察比較16∶0/18∶1 PG和18∶0/22∶6 PG子離子的相對強度,結(jié)果發(fā)現(xiàn):16∶0/18∶1 PG碎裂形成的酰基陽離子相對強度為R1CO+低于R2CO+,而18∶0/22∶6 PG碎裂形成的?；栯x子相對強度為R1CO+高于R2CO+;但兩種PG丟失脂肪?；鶊F(tuán)作為烯酮的中性丟失而產(chǎn)生的離子[M-171-R’XH=CO]+均為[M-171-R’1H=CO]+的強度高于[M-171-R’2H=CO]+。故正離子模式下,PG可根據(jù) M-171-R’1H=CO]+和[M-171-R’2H=CO]+相對強度來確定脂肪?；恢?。
2.2.5 PS PS在正離子 ESI源下易形成[M+H]+離子,此類離子也易通過失去極性頭部基團(tuán)而產(chǎn)生[M-184]+。分別對 16∶0/18∶1PS和18∶0/18∶1 PS的[M+H]+離子做二級質(zhì)譜發(fā)現(xiàn),這兩種PS裂解形成?；栯x子的相對離子豐度均為R1CO+低于R2CO+,而其他子離子的相對豐度則較低。所以對于 PS而言,正離子模式下可根據(jù)R1CO+和R2CO+相對豐度高低直接確定?；奈恢?。
3 結(jié)論
綜上所述,ESI源負(fù)離子模式下,PA、PC、PS、PE、PG、PI均可以根據(jù) [M-H-R’XCH=CO]-或[M-H-RXCOOH]-(PC根據(jù)[M-H-CH3-R’XCH=CO]-或[M-HCH3-RXCOOH]-,PS根據(jù)[M-H-87-R’XCH=CO]-或 [M-H-87-RXCOOH]-,且X=1,2)相應(yīng)的相對離子強度大小來確定磷脂脂肪?；奈恢?即[M-HR2COOH]-的離子強度總是高于[M-HR1COOH]-強度 ,而[M-H-R’2CH=CO]-豐度總是高于[M-H-R’1CH=CO]-豐度。
考慮到某類磷脂在一定條件下,上述離子豐度可能較低,則可以選擇其他離子豐度比變化來進(jìn)行輔助定性。在負(fù)離子模式下,對于 PA、PC、PS而言,可利用sn-1、sn-2位羧酸陰離子的豐度比來確定?；奈恢?其中PA和 PS母離子裂解產(chǎn)生的羧酸陰離子豐度比均為 R1COO-＞R2COO-,PC則為 R1COO-＜R2COO-。由于PA、PC、PS產(chǎn)生的羧酸陰離子的豐度都高于其它子離子的豐度,故利用 R1COO-和 R2COO-的豐度比確定酰基所在位置是簡便、直觀的。
在正離子模式下,PS的?；栯x子R1CO+豐度總是低于R2CO+;PA和PC在低碰撞能量下,sn-1脂肪酰基基團(tuán)作為烯酮的中性丟失而產(chǎn)生的離子豐度總是低于sn-2位上產(chǎn)生的對應(yīng)離子;而對于PE和 PG而言,在低碰撞能量下,其sn-1脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸的中性丟失而產(chǎn)生的離子豐度高于sn-2位上產(chǎn)生的對應(yīng)離子。這些規(guī)律可以作為對應(yīng)磷脂在對應(yīng)條件下的輔助定性。
[1]WANG X M.Lipid signaling[J].Current Opinion in Plant Biology,2004,7(3):329-336.
[2]HAGIO M,GOMBOS Z,VáRKONYI Z,et al.Direct evidence for requirement of phosphatidylglycerol in photosystem IIof photosynthesis[J].A-merican Society of Plant Physiologists,2000,124(2):795-804.
[3]JONESM R.Lipids in photosynthetic reaction centres:Structural roles and functional holes[J].Progress in Lipid Research,2007,46(1):56-87.
[4]SOM ERV ILLE C,BROWSE J.Plant lipids:Metabolism,mutants,and membranes[J].Science,1991,252(5 002):80-87.
[5]HSU F F,TURKJ.Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation.A mechanistic p roposal[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(9):797-803.
[6]HSU F F,TURK J.Studies on phosphatidylserine by tandem quadrupole and multip le stage quadrupole ion-trap mass spectrometry with electrosp ray ionization:Structural characterization and the fragmentation processes[J].J Am Soc Mass Spectrom,2005,16(9):1 510-1 522.
[7]HSU F F,TURK J.Charge-remote and chargedriven fragmentation processes in diacyl glycerophosphoethanolamine upon low-energy collisional activation:A mechanistic p roposal[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(10):892-899.
[8]HSU F F,TURK J.Studieson phosphatidylglycerol with triple quadrupole tandem mass spectrometry with electrosp ray ionization:Fragmentation processes and structural characterization[J].J Am Soc Mass Spcctrom,2001,12(9):1 036-1 042.
[9]HSU F F,TURK J.Characterization of phosphatidylinositol, phosphatidylinositol-4-phosphate,and phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate by electrosp ray ionization tandem mass spectrometry:A mechanistic study[J].J Am Soc Mass Spcctrom,2000,11(11):986-999.
[10]HSU F F,TURK J.Electrosp ray ionization with low-energy collisionally activated dissociation tandem mass spectrometry of glycerophospholipids:Mechanisms of fragmentation and structural characterization[J].Journal of Chromatography B,2009,877(26):2 673-2 695.
[11]HVA TTUM E,HAGEL IN G,LARSEN A.Study of mechanism s involved in the collision-induced dissociation of carboxylate anions from glycerophospholipids using negative ion electrosp ray tandem quadrupole mass spectrometry[J].Rapid Commum Mass Spectrom,1998,12(19):1 405-1 409.
[12]JENSEN N J,TOM ER KB,GROSSM L.Fast atom bombardment and tandem mass spectrometry of phosphatidylserine and phosphatidylcholine[J].Lipids,1986,21(9):580-588.
[13]HAN X L,GROSS R W.Structural determination of picomole amounts of phospholipids via electrosp ray ionization tandem mass spectrometry[J].J Am Soc Mass Spcctrom,1995,6(12):1 202-1 210.
Characterization of Fatty Acyl Location in Phospholipids by Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry Using the Function of Collision Energy Automatic Optim ization
SU Xiao-ling,XU Ji-lin,CHEN Juan-juan,ZHAO Peng,YAN Xiao-jun
(Key Laboratory of A pp lied M arine Biotechnology,Ministry of Education,N ingbo University,Ningbo 315211,China)
Utilizing the function of collision energy automatic op timization,the fragmentation patterns of the phospholipids standards,including classes of glycerophosphatidic acid(PA),glycerophosphocholine(PC),glycerophosphoethanolamine(PE),glycerophosphoserine(PS),glycerophosphoglycerol(PG)and glycerophosphoinositol(PI)were studied both in negative and positive modes by triple quadrupole tandem mass spectrometry.It could be inferred that,for all classes of phospholipids,the intensities of the ions arising from neutral loss of the sn-2 substituent as a free fatty acid([M-H-R2COOH]-)or ketene([M-H-R‘2CH=CO]-)are stronger than those of corresponding ions generated byloss of the sn-1 substituent.According to this rule,it was readily to confirm the position of acyl group.In addition,it was easy to elimination of carboxylate substituent from sn-2 position for PC,which meant that the intensity of R2COO-was higher than that of R1COO-.While for PA and PS,the phenomena were totally opposite to that of PC and the intensity of R2COO-was weaker than that of R1COO-.W hen in the positive ion mode,the intensity of acylium ion from the sn-1 position was weaker than the acylium ion from the sn-2 position for PS.Moreover,at low collision energy,for PA and PC species it could be found that the intensities of the ions arising from neutral loss of the sn-2 substituent as a ketene([MH-R’2CH=CO]-)w ere greater than those of ions reflecting corresponding losses of the sn-1 substituent at low collision energy.However,for PE and PG,the intensity of the ion by loss of R1CO2H was stronger than that of ion by elimination of R2CO2H.These fragmentation rules could be used to determine the position of the fatty-acyl substituent of glycerol backbone.
triple quadrupole tandem mass spectrometry;phospholipids;fatty-acyl location
O 657.63
A
1004-2997(2011)04-0200-07
2010-09-25;
2010-12-10
教育部長江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊項目 (IRT0734)、浙江省公益性項目(2010C32G2070011)、浙江省自然科學(xué)基金(Y3100534)、寧波市自然科學(xué)基金(2009A 610117)資助
蘇小玲(1988～),女(漢族),浙江溫州人,碩士研究生,從事微型藻類的生物化學(xué)研究。E-mail:lingluck312@163.com
嚴(yán)小軍(1968～),男(漢族),江蘇蘇州人,研究員,從事微型藻類的生物化學(xué)研究。E-mail:yanxiaojun@nbu.edu.cn
蘇小玲,徐繼林,陳娟娟,趙 鵬,嚴(yán)小軍
(寧波大學(xué),應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)
利用QqQ-MS碰撞能量自動優(yōu)化功能確定磷脂脂肪?；恢?/p>
蘇小玲,徐繼林,陳娟娟,趙 鵬,嚴(yán)小軍
(寧波大學(xué),應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江寧波 315211)
利用三重四極桿質(zhì)譜碰撞能量自動優(yōu)化功能,在正、負(fù)離子檢測模式下,對磷脂標(biāo)準(zhǔn)品(包括 PA,PC,PE,PS,PG,PI)不同碰撞能量下子離子的裂解規(guī)律進(jìn)行研究。實驗發(fā)現(xiàn):在負(fù)離子模式下,各類磷脂的子離子[M-H-R2COOH]-強度總是高于[M-H-R1COOH]-強度,而[M-H-R’2CH=CO]-豐度總是高于[M-H-R’1CH=CO]-豐度,這個規(guī)律可以用于確定左右磷脂的?；恢谩Ａ硗?在負(fù)離子模式下,PA和PS母離子裂解產(chǎn)生的羧酸陰離子豐度比均為R1COO-高于R2COO-,PC則為R1COO-低于R2COO-;在正離子模式下,PS裂解產(chǎn)生的?；栯x子R1CO+豐度總是低于R2CO+,PA和PC在低碰撞能量下,sn-1脂肪?；鶊F(tuán)作為烯酮的中性丟失而產(chǎn)生離子豐度總是低于sn-2位上產(chǎn)生的對應(yīng)離子;而PE和PG的sn-1位脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸的中性丟失而產(chǎn)生的離子在低碰撞能量下的豐度高于sn-2位上產(chǎn)生的離子。這些規(guī)律可用于輔助確定磷脂脂肪?；奈恢谩?/p>
三重四極桿質(zhì)譜;磷脂;脂肪?；恢?/p>
天然磷脂是含磷酸的類脂化合物,它除了構(gòu)成生物膜外,還參與細(xì)胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)功能[1],同時,在影響植物光合作用效率[2-3]等方面也發(fā)揮著重要作用。磷脂的基本結(jié)構(gòu)示于圖1。同一類磷脂之間的差別體現(xiàn)在?；舅峤M成和位置的不同,而確定磷脂不同位置的脂肪?；M成對研究生物體磷脂的合成途徑有著重要的意義[4]。
圖1 磷脂的基本結(jié)構(gòu)Fig.1 The general structure of glycerophospholipids
目前,多采用三重四極桿質(zhì)譜(QqQ-MS)或線性離子阱質(zhì)譜(L IT-M S)研究磷脂脂肪?；牧呀庖?guī)律[5-10],但均是取某一特定碰撞能量研究磷脂的裂解情況,而并未將整個碰撞能量范圍進(jìn)行全面的考慮。Hvattuma等[11]研究發(fā)現(xiàn),18:0/20:4 PE在低碰撞能量下更有利于 sn-2的丟失,而在高能量下,sn-1則更易丟失。這說明某些磷脂在不同碰撞能量下其子離子的相對豐度會發(fā)生變化。三重四極桿質(zhì)譜碰撞能量自動優(yōu)化功能可以直觀給出同一母離子的不同子離子豐度與碰撞能量的變化曲線,從而根據(jù)各離子相對豐度的變化來研究磷脂分子中不同?；奈恢谩?/p>
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
TSQ Quantum Access三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng):美國 Thermo Fisher公司產(chǎn)品;超純水系統(tǒng):美國M illipore公司產(chǎn)品。
磷脂酸(PA)、卵磷脂(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)標(biāo)準(zhǔn)品:美國Avanti Polar Lipids公司產(chǎn)品;甲酸(色譜純):美國 Sigma-A ldrich公司產(chǎn)品;其他試劑(色譜純):美國 Tedia公司產(chǎn)品;純水由超純水系統(tǒng)制備。
1.2 實驗方法
1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 取各標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇稀釋至 1 g/L,再用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(乙酸銨)=300∶665∶35的溶液進(jìn)一步稀釋至10 mg/L,直接進(jìn)樣上機分析。
1.2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離(ESI)源正、負(fù)離子電離模式,噴霧電壓2 800 V,鞘氣流量12 L/m in,輔助氣流量 4 L/m in,離子傳輸毛細(xì)管溫度350℃,選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式,碰撞室能量采用5～80 V進(jìn)行掃描。正離子模式下蠕動泵流速10μL/m in;負(fù)離子模式下蠕動泵流速 8μL/min。碰撞氣為氬氣,碰撞氣壓力23.79 Pa。
2 結(jié)果與討論
2.1 負(fù)離子模式下各磷脂分子裂解規(guī)律
磷脂骨架是甘油骨架,其中sn-1和sn-2位兩個羥基通過酯鍵分別連接兩個脂肪酸鏈,另一羥基連接極性頭部。ESI源負(fù)離子模式下,磷脂多以[M-H]-離子存在,對其做二級質(zhì)譜分析,在5～80 V范圍內(nèi)改變碰撞能量,觀察得到的子離子形式包括sn-1羧酸陰離子(R1COO-),sn-2羧酸陰離子(R2COO-),也會形成對應(yīng)于 sn-1和sn-2位脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸和烯酮的中性丟失而產(chǎn)生的離子[M-H-RXCOOH]-和[M-H-R’XCH=CO]-(RX=RX’CH2)。
選擇得到的子離子作為研究對象,利用三重四極桿質(zhì)譜碰撞能量自動優(yōu)化的功能,對產(chǎn)生相應(yīng)子離子的碰撞能量進(jìn)行自動優(yōu)化,儀器可以自動給出各子離子豐度隨著碰撞能量改變而變化的曲線,示于圖2。
2.1.1 羧酸陰離子(RXCOO-)的裂解規(guī)律以PA為例,圖2是 16∶0/18∶1 PA的m/z673([M-H]-)母離子產(chǎn)生子離子時,碰撞能量自動優(yōu)化后各子離子豐度隨著碰撞能量變化而變化的曲線。從圖中可以看出,在碰撞能量變化的整個范圍內(nèi),處在sn-1位的脂肪?；鶊F(tuán)形成的m/z255負(fù)離子(R1COO-)的豐度總是大于處在sn-2位的脂肪酰基基團(tuán)形成的m/z281(R2COO-)(圖2a),此規(guī)律在 18∶0/22∶6 PA的m/z747([M-H]-)母離子產(chǎn)生的相應(yīng)子離子變化中同樣出現(xiàn)?？梢娫诒緦嶒炛?無論是16∶0/18∶1 PA 還是 18∶0/22∶6 PA,都是sn-1位更容易斷裂,在對應(yīng)變化圖上位于上方的曲線代表的?；鶊F(tuán)就位于sn-1,位于下方的曲線代表的?；鶊F(tuán)就位于 sn-2位。Hsu等[5]利用 ESI源QqQ-M S在低碰撞能量下研究了 PA的裂解規(guī)律,發(fā)現(xiàn) 16∶0/18∶1、18∶0/20∶4 PA子離子豐度比為 R1COO-＞R2COO-。因此可以認(rèn)為,PA的子離子豐度R1COO-總是大于R2COO-。
圖2 16∶0/18∶1 PA[M-H]-離子所產(chǎn)生的不同子離子在不同碰撞能量下的相對豐度Fig.2 The relative intensity of product ion arising from the dissociation of[M-H]-ion of C16∶0/18∶1 PA at different collision energies
對于其他磷脂而言,由于極性頭部的不同,各子離子豐度隨著碰撞能量變化的規(guī)律并不一致。Vensen[12]利用快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-M S)研究PC負(fù)離子模式時的裂解情況,發(fā)現(xiàn)sn-2位羧酸陰離子的相對豐度大約是sn-1位的2倍;而 Hsu等[6]利用多級串聯(lián)離子阱質(zhì)譜詳細(xì)研究正負(fù)離子模式下的 PS裂解,發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下R1COO-的豐度高于 R2COO-。他們均是取某一特定碰撞能量研究磷脂的裂解情況,而并未將整個碰撞能量范圍進(jìn)行全面考慮。本實驗另外選取 2種 PA、PC、PS、PE、PG、PI,觀察其在不同碰撞能量下羧酸陰離子的相對豐度,結(jié)果列于表1。由表1可知,與 PA類似,PS sn-1位的羧酸陰離子豐度也總是高于sn-2位,即 R1COO-＞R2COO-。Hvattuma等[11]研究了 18∶0/20∶4 PS、PA,也得到了相同的規(guī)律,這證實了本實驗結(jié)果的正確性。而對于PC而言,無論是14∶0/18∶1還是 18∶1/14∶0,結(jié)果均顯示R2COO-＞R1COO-。Han等[13]研究了碰撞能量為18～25 V PC(16∶0/18∶1、16∶0/18∶2、18∶0/18∶1、16∶0/20∶4),發(fā)現(xiàn) sn-2位產(chǎn)生的羧酸陰離子是sn-1位的3倍,這與本實驗得到的結(jié)果一致。
這種具有同樣?；庪x子相對豐度大小的規(guī)律并非存在于所有磷脂裂解過程中。有報道指出,磷脂分子甘油骨架上?；湹奈恢脤Ψ肿与x子解離影響較大,sn-1與sn-2裂解豐度比值取決于sn-2位上酰基鏈的長短及不飽和鍵的數(shù)目[13]。本實驗中,PE、PG、PI在負(fù)離子模式下羧酸陰離子未發(fā)現(xiàn)一致的規(guī)律。例如 PG,16∶0/18∶1 PG在不同的碰撞能量下,R2COO-曲線始終高于 R1COO-曲線;而對于18∶0/22∶6 PG而言,當(dāng)碰撞能量在5～30 V時,sn-1位?；x子豐度與sn-2位幾乎一樣,當(dāng)能量提高時,R1COO-豐度高于R2COO-豐度,示于圖3,所以無法用這兩個離子的相對豐度變化來定性這些磷脂的?；恢?。
表1 各類磷脂標(biāo)準(zhǔn)品在5～80 V碰撞能量下,sn-1和sn-2位羧酸陰離子的相對豐度比Table 1 The relative abundance ratio of carboxylate anion from sn-1 or sn-2 from 6 classes of phospholipids under different collision energies(5～80 V)
2.1.2 負(fù)離子模式下[M-H-R’XCH=CO]-,[M-H-RXCOOH]-的裂解規(guī)律 仍以PA為例,進(jìn)一步觀察16∶0/18∶1 PA的m/z673([M-H]-)母離子產(chǎn)生的其他子離子可見,子離子m/z391[M-H-R2COOH]-的豐度在各碰撞能量下總是高于m/z417[MH-R1COOH]-;而子離子m/z409[M-HR’2CH=CO]-的豐度始終高于m/z435[MH-R’1CH=CO]-,這些結(jié)果說明 ,16∶0/18∶1 PA的sn-2位比sn-1位更有利于脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸和烯酮的中性丟失。
從表1可見,PE、PG、PI各羧酸陰離子的豐度之間沒有類似 PA、PC、PS所具有的共同規(guī)律。為了確認(rèn)PA、PC、PS其他子離子是否也具有一致的裂解規(guī)律,進(jìn)一步考察了其他子離子之間的豐度變化。選擇對比[M-H-R’XCH=CO]-、[M-H-RXCOOH]-相對離子豐度發(fā)現(xiàn),隨著碰撞能量的增加,所有標(biāo)準(zhǔn)脂[M-HR1COOH]-豐度總是小于[M -HR2COOH]-,同時 ,[M-H-R’1CH=CO]-豐度也總是小于[M-H-R’2H=CO]-。Hsu等[7-10]在某一能量下對 PE 18∶0/16∶0,PG 18∶1/16∶0、18∶0/20∶4,PI的研究也得到了同樣的結(jié)論。故這6種磷脂分子均可根據(jù)[MH-R’XCH=CO]-或[M-H-RXCOOH]-(PC根據(jù)[M-H-CH3-R’XCH=CO]-或[M-H-CH3-RXCOOH]-,PS根據(jù)[M-H-87-R’XCH=CO]-或 [M-H-87-RXCOOH]-,且X=1,2)豐度直接確定酰基所在的位置。但是由于羧酸陰離子的豐度都高于其他子離子的豐度(例如 PA),所以對于PA、PC、PS 來說 ,用 R1COO-和 R2COO-豐度比確定?；谖恢酶啽恪⒅庇^。
2.2 正離子模式下各磷脂分子裂解規(guī)律
2.2.1 PA ESI源正離子模式下,PA多以[M+H]+離子存在,同時,PA易發(fā)生中性丟失極性頭部(H3PO4)而產(chǎn)生[M+H-98]+子離子。以 16∶0/18∶1 PA為例,對[M+H-98]+做二級質(zhì)譜,觀察所產(chǎn)生的碎片離子,發(fā)現(xiàn)包含裂解產(chǎn)生的m/z339[M+H-98-R’1CH=CO]+、m/z313[M+H-98-R’2H=CO]+。另外,PA[M+H-98]+做二級質(zhì)譜碎裂得到?；栯x子分別為m/z239 R1CO+和m/z265 R2CO+。
比較上述觀察所得到的子離子相對豐度,發(fā)現(xiàn)m/z239的相對豐度低于m/z265,但在整個碰撞能量范圍內(nèi),二者的豐度比較接近;在低碰撞能量(＜30 V)下,m/z339相對豐度明顯低于m/z313,在碰撞能量30～45 V下,m/z339的豐度則高于m/z313。對18∶0/22∶6 PAm/z651[M+H-98]+做二級質(zhì)譜,觀察到m/z267(R1CO+)豐度明顯高于m/z311(R2CO+)。當(dāng)碰撞能量小于50 V時,m/z385[M+H-98-R’1CH=CO]+豐度明顯低于m/z341[M+H-98-R’2H=CO]+;當(dāng)碰撞能量高于45 V時,二者的豐度均很低。對于m/z367[M+H-98-R1COOH]+和m/z323[M+H-98-R2COOH]+而言,在能量小于40 V時,m/z367明顯高于m/z323。據(jù)此,在低碰撞能量下可以根據(jù)[M+H-98-R’1CH=CO]+和[M+H-98-R’2H=CO]+的相對離子強度確定 PA?；幍奈恢谩?/p>
2.2.2 PC 14∶0/18∶1 PC和18∶1/14∶0 PC在正離子模式下不僅可以產(chǎn)生[M+H]+離子,還可以產(chǎn)生[M+Na]+,但[M+Na]+信號強度較低,故選擇[M+H]+離子做二級質(zhì)譜。對兩種PC酰基陽離子做碰撞能量自動優(yōu)化,得到的信號強度均很低,不利于做比較。在本實驗中,發(fā)現(xiàn)sn-2位比sn-1位更有利于脂肪酸酰基基團(tuán)丟失,這體現(xiàn)在碰撞能量小于50 V時,[M+H-R’2H=CO]+的相對豐度高于[M+H-R’1H=CO]+(能量大于 50 V時,[M+H-R’XH=CO]+信號強度很低,接近于 0)。Hsu等[6]利用串聯(lián)四極桿質(zhì)譜研究了16∶0/18∶1 PC,同樣發(fā)現(xiàn)了正離子模式下[M+HR’2H=CO]+的相對豐度總是高于[M+HR’1H=CO]+。所以,對于 PC而言,正離子模式下脂肪酰基在甘油骨架的位置可通過此規(guī)律來確定。
2.2.3 PE PE易中性丟失C2H8O4NP(141 u)形成[M+H-141]+離子 ,故 16∶0/18∶1 PE和18∶0/22∶6 PE的母離子m/z718[M+H]+和m/z792[M+H]+在正離子模式的主要子離子是m/z577和m/z651。觀察 16∶0/18∶1 PE的其他子離子,發(fā)現(xiàn)R1CO+豐度明顯低于R2CO+;[M+H-141-R1COOH]+的離子豐度在碰撞能量小于35 V時總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度,高碰撞能量下二者得到的信號均很低;另外,能量小于30 V時,m/z339[M+H-141-R’1H=CO]+的強度高于m/z313[M+H-141-R’2H=CO]+,能量大于30 V時,m/z339低于m/z313,示于圖4。觀察18∶0/22∶6 PE則發(fā)現(xiàn),R1CO+豐度總是高于R2CO+,[M+H-141-R1COOH]+的離子豐度總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度 ,[M+H-141-R’1H=CO]+的強度低于[M+H-141-R’2H=CO]+。仔細(xì)分析上述規(guī)律,可發(fā)現(xiàn)共有規(guī)律為PE所產(chǎn)生的子離子[M+H-141-R1COOH]+豐度在低碰撞能量下總是高于[M+H-141-R2COOH]+豐度,因此,可以直接確定出PE?；幍奈恢谩?/p>
圖4 16∶0/18∶1 PE子離子[M-140-R1 COOH]+和[M-140-R2 COOH]+的相對離子強度Fig.4 The relative intensity of the[M-140-R1COOH]+and the[M-140-R2 COOH]+from C16∶0/18∶1 species of PGat different collision energies
2.2.4 PG PG在正離子模式下極易丟失包括磷酸在內(nèi)的極性頭部基團(tuán)而形成特征離子[M-171]+。另外,16∶0/18∶1 PG[M+H]+離子強度很低,故選擇[M-171]+做二級質(zhì)譜,分別觀察比較16∶0/18∶1 PG和18∶0/22∶6 PG子離子的相對強度,結(jié)果發(fā)現(xiàn):16∶0/18∶1 PG碎裂形成的酰基陽離子相對強度為R1CO+低于R2CO+,而18∶0/22∶6 PG碎裂形成的?；栯x子相對強度為R1CO+高于R2CO+;但兩種PG丟失脂肪?；鶊F(tuán)作為烯酮的中性丟失而產(chǎn)生的離子[M-171-R’XH=CO]+均為[M-171-R’1H=CO]+的強度高于[M-171-R’2H=CO]+。故正離子模式下,PG可根據(jù) M-171-R’1H=CO]+和[M-171-R’2H=CO]+相對強度來確定脂肪?；恢?。
2.2.5 PS PS在正離子 ESI源下易形成[M+H]+離子,此類離子也易通過失去極性頭部基團(tuán)而產(chǎn)生[M-184]+。分別對 16∶0/18∶1PS和18∶0/18∶1 PS的[M+H]+離子做二級質(zhì)譜發(fā)現(xiàn),這兩種PS裂解形成?；栯x子的相對離子豐度均為R1CO+低于R2CO+,而其他子離子的相對豐度則較低。所以對于 PS而言,正離子模式下可根據(jù)R1CO+和R2CO+相對豐度高低直接確定?；奈恢?。
3 結(jié)論
綜上所述,ESI源負(fù)離子模式下,PA、PC、PS、PE、PG、PI均可以根據(jù) [M-H-R’XCH=CO]-或[M-H-RXCOOH]-(PC根據(jù)[M-H-CH3-R’XCH=CO]-或[M-HCH3-RXCOOH]-,PS根據(jù)[M-H-87-R’XCH=CO]-或 [M-H-87-RXCOOH]-,且X=1,2)相應(yīng)的相對離子強度大小來確定磷脂脂肪?；奈恢?即[M-HR2COOH]-的離子強度總是高于[M-HR1COOH]-強度 ,而[M-H-R’2CH=CO]-豐度總是高于[M-H-R’1CH=CO]-豐度。
考慮到某類磷脂在一定條件下,上述離子豐度可能較低,則可以選擇其他離子豐度比變化來進(jìn)行輔助定性。在負(fù)離子模式下,對于 PA、PC、PS而言,可利用sn-1、sn-2位羧酸陰離子的豐度比來確定?；奈恢?其中PA和 PS母離子裂解產(chǎn)生的羧酸陰離子豐度比均為 R1COO-＞R2COO-,PC則為 R1COO-＜R2COO-。由于PA、PC、PS產(chǎn)生的羧酸陰離子的豐度都高于其它子離子的豐度,故利用 R1COO-和 R2COO-的豐度比確定酰基所在位置是簡便、直觀的。
在正離子模式下,PS的?；栯x子R1CO+豐度總是低于R2CO+;PA和PC在低碰撞能量下,sn-1脂肪酰基基團(tuán)作為烯酮的中性丟失而產(chǎn)生的離子豐度總是低于sn-2位上產(chǎn)生的對應(yīng)離子;而對于PE和 PG而言,在低碰撞能量下,其sn-1脂肪?；鶊F(tuán)作為羧酸的中性丟失而產(chǎn)生的離子豐度高于sn-2位上產(chǎn)生的對應(yīng)離子。這些規(guī)律可以作為對應(yīng)磷脂在對應(yīng)條件下的輔助定性。
[1]WANG X M.Lipid signaling[J].Current Opinion in Plant Biology,2004,7(3):329-336.
[2]HAGIO M,GOMBOS Z,VáRKONYI Z,et al.Direct evidence for requirement of phosphatidylglycerol in photosystem IIof photosynthesis[J].A-merican Society of Plant Physiologists,2000,124(2):795-804.
[3]JONESM R.Lipids in photosynthetic reaction centres:Structural roles and functional holes[J].Progress in Lipid Research,2007,46(1):56-87.
[4]SOM ERV ILLE C,BROWSE J.Plant lipids:Metabolism,mutants,and membranes[J].Science,1991,252(5 002):80-87.
[5]HSU F F,TURKJ.Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation.A mechanistic p roposal[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(9):797-803.
[6]HSU F F,TURK J.Studies on phosphatidylserine by tandem quadrupole and multip le stage quadrupole ion-trap mass spectrometry with electrosp ray ionization:Structural characterization and the fragmentation processes[J].J Am Soc Mass Spectrom,2005,16(9):1 510-1 522.
[7]HSU F F,TURK J.Charge-remote and chargedriven fragmentation processes in diacyl glycerophosphoethanolamine upon low-energy collisional activation:A mechanistic p roposal[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(10):892-899.
[8]HSU F F,TURK J.Studieson phosphatidylglycerol with triple quadrupole tandem mass spectrometry with electrosp ray ionization:Fragmentation processes and structural characterization[J].J Am Soc Mass Spcctrom,2001,12(9):1 036-1 042.
[9]HSU F F,TURK J.Characterization of phosphatidylinositol, phosphatidylinositol-4-phosphate,and phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate by electrosp ray ionization tandem mass spectrometry:A mechanistic study[J].J Am Soc Mass Spcctrom,2000,11(11):986-999.
[10]HSU F F,TURK J.Electrosp ray ionization with low-energy collisionally activated dissociation tandem mass spectrometry of glycerophospholipids:Mechanisms of fragmentation and structural characterization[J].Journal of Chromatography B,2009,877(26):2 673-2 695.
[11]HVA TTUM E,HAGEL IN G,LARSEN A.Study of mechanism s involved in the collision-induced dissociation of carboxylate anions from glycerophospholipids using negative ion electrosp ray tandem quadrupole mass spectrometry[J].Rapid Commum Mass Spectrom,1998,12(19):1 405-1 409.
[12]JENSEN N J,TOM ER KB,GROSSM L.Fast atom bombardment and tandem mass spectrometry of phosphatidylserine and phosphatidylcholine[J].Lipids,1986,21(9):580-588.
[13]HAN X L,GROSS R W.Structural determination of picomole amounts of phospholipids via electrosp ray ionization tandem mass spectrometry[J].J Am Soc Mass Spcctrom,1995,6(12):1 202-1 210.
Characterization of Fatty Acyl Location in Phospholipids by Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry Using the Function of Collision Energy Automatic Optim ization
SU Xiao-ling,XU Ji-lin,CHEN Juan-juan,ZHAO Peng,YAN Xiao-jun
(Key Laboratory of A pp lied M arine Biotechnology,Ministry of Education,N ingbo University,Ningbo 315211,China)
Utilizing the function of collision energy automatic op timization,the fragmentation patterns of the phospholipids standards,including classes of glycerophosphatidic acid(PA),glycerophosphocholine(PC),glycerophosphoethanolamine(PE),glycerophosphoserine(PS),glycerophosphoglycerol(PG)and glycerophosphoinositol(PI)were studied both in negative and positive modes by triple quadrupole tandem mass spectrometry.It could be inferred that,for all classes of phospholipids,the intensities of the ions arising from neutral loss of the sn-2 substituent as a free fatty acid([M-H-R2COOH]-)or ketene([M-H-R‘2CH=CO]-)are stronger than those of corresponding ions generated byloss of the sn-1 substituent.According to this rule,it was readily to confirm the position of acyl group.In addition,it was easy to elimination of carboxylate substituent from sn-2 position for PC,which meant that the intensity of R2COO-was higher than that of R1COO-.While for PA and PS,the phenomena were totally opposite to that of PC and the intensity of R2COO-was weaker than that of R1COO-.W hen in the positive ion mode,the intensity of acylium ion from the sn-1 position was weaker than the acylium ion from the sn-2 position for PS.Moreover,at low collision energy,for PA and PC species it could be found that the intensities of the ions arising from neutral loss of the sn-2 substituent as a ketene([MH-R’2CH=CO]-)w ere greater than those of ions reflecting corresponding losses of the sn-1 substituent at low collision energy.However,for PE and PG,the intensity of the ion by loss of R1CO2H was stronger than that of ion by elimination of R2CO2H.These fragmentation rules could be used to determine the position of the fatty-acyl substituent of glycerol backbone.
triple quadrupole tandem mass spectrometry;phospholipids;fatty-acyl location
O 657.63
A
1004-2997(2011)04-0200-07
2010-09-25;
2010-12-10
教育部長江學(xué)者與創(chuàng)新團(tuán)隊項目 (IRT0734)、浙江省公益性項目(2010C32G2070011)、浙江省自然科學(xué)基金(Y3100534)、寧波市自然科學(xué)基金(2009A 610117)資助
蘇小玲(1988～),女(漢族),浙江溫州人,碩士研究生,從事微型藻類的生物化學(xué)研究。E-mail:lingluck312@163.com
嚴(yán)小軍(1968～),男(漢族),江蘇蘇州人,研究員,從事微型藻類的生物化學(xué)研究。E-mail:yanxiaojun@nbu.edu.cn
