糖尿病大鼠胃動力變化與胃血管變化的關(guān)系

張喜娟 嚴(yán) 祥 孫少華 陳 明 尹 紅 王 薇 (蘭州大學(xué)第一醫(yī)院老年病科，甘肅 蘭州 730000)

糖尿病大鼠胃動力變化與胃血管變化的關(guān)系

張喜娟 嚴(yán) 祥 孫少華 陳 明 尹 紅 王 薇 (蘭州大學(xué)第一醫(yī)院老年病科，甘肅 蘭州 730000)

目的 研究糖尿病(DM)胃動力變化與胃血管變化的關(guān)系。方法 采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)并小劑量鏈脲佐菌素(STZ)注射破壞胰島β細胞制造DM模型。分別于4 w、24 w時應(yīng)用單光子發(fā)射斷層顯像儀(SPECT)技術(shù)測定胃排空，觀察血內(nèi)皮素(ET-1)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、血管性假性血友病因子(vWF)，并在顯微鏡下觀察胃血管的病理變化。結(jié)果 24 w模型組大鼠血漿TM、vWF、ET-1顯著升高，4 w模型組輕度升高。顯微鏡觀察見早期血管內(nèi)皮輕度損害，微血管代償性增加，胃動力加快。隨著病程進展，血管內(nèi)皮損害進一步加重，胃黏膜微血管逐漸減少，毛細血管擴張，黏膜下及肌層小血管管壁增厚，管腔狹窄，管壁/管腔比值明顯增大，胃動力延緩。結(jié)論 DM胃動力變化與胃血管變化相關(guān)，微血管變化可能是引起胃動力變化的始動因素。

胃動力;血管;糖尿病;大鼠;內(nèi)皮細胞

糖尿病(DM)胃排空延遲影響降糖藥的藥代動力學(xué)，使降糖藥的吸收遲滯，與進食后血糖的高峰不匹配，造成血糖控制不良，與此同時由于血藥濃度高峰的遲滯又可能引起低血糖，造成血糖不穩(wěn)定。國外資料顯示50%的DM患者有胃排空障礙〔1〕。國內(nèi)外對DM胃動力障礙的研究逐漸增多，但其機制尚不清楚。目前主要認為與神經(jīng)病變、高血糖、血清胃腸激素異常、微血管病變及代謝紊亂有關(guān)，其中血管病變對DM胃動力的影響研究較少。本實驗旨在探討引起DM胃動力變化的原因，研究DM胃動力變化與胃血管變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠72只，體重180～200 g，甘肅省中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)在蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與毒理教研室動物實驗室。屏障環(huán)境飼養(yǎng)，自由進食飲水。

1.1.2 實驗試劑 鏈脲佐菌素(STZ，美國 Sigma公司);ELISA試劑盒(美國ADL公司);免疫組化試劑盒(武漢博士德公司);DAB顯色劑(福建麥新公司);Masson染液(福建麥新公司)、血清胰島素(FIN)放射免疫檢測試劑盒(北京華英生物技術(shù)公司)。

1.1.3 實驗儀器 多功能時間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)(WALLAC VICTOR2-1420，芬蘭);以色列針孔型探頭單光子發(fā)射計算機斷層照相儀(SPECT，以色列Elscint Helix公司);穩(wěn)步倍加型血糖儀(美國強生公司);LX-20型全自動生化分析儀(美國Beckman-coulter公司);U-MDOB3顯微鏡(日本 OLYMPUS);2510-變頻振蕩器(上海新波生物技術(shù)有限公司);臺式恒溫隔水培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);Image-proplus多媒體圖像分析儀(美國Media Cyber-netics公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠胃輕癱模型的制作 SPF級雄性Wistar大鼠72只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為正常對照組(n=24)、實驗組(n=48)。兩組大鼠自由飲水進食，正常對照組以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，實驗組大鼠每天以高脂高糖飼料(10.0%豬油﹑20.0%白糖﹑2.5%膽固醇、1%膽酸鹽﹑66.5%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)，連續(xù)6 w，每周定時稱重一次。喂養(yǎng)6 w后，正常對照組經(jīng)腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液，實驗組經(jīng)腹腔注射枸櫞酸緩沖液配制2%的STZ，劑量為30 mg/kg體重，注射后4 h予50%的葡萄糖水1 ml灌胃。72 h后尾靜脈采血測定空腹血糖，以空腹血糖高于16.7mmol/L確定為DM模型建立成功。符合標(biāo)準(zhǔn)的44只。4只不達標(biāo)者，3 d后補注STZ(以15mg/kg體重劑量腹腔補注)，有3只成模，最終達標(biāo)的模型動物有47只。造模成功后，不用胰島素和任何降糖藥物控制血糖以普通飼料以及飲食失節(jié)法繼續(xù)飼養(yǎng)，每周測血糖、體重。4 w隨機取實驗組及對照組各12只用單光子發(fā)射斷層顯像儀(SPECT)測定胃排空，活體心臟采血留取血液后處死，取胃組織及血管標(biāo)本保存。剩余47只(實驗組35只，對照組12只)繼續(xù)飼養(yǎng)24 w，每2周檢測血糖和體重。在此期間自發(fā)性恢復(fù)1只，因各種并發(fā)癥死亡6只。模型納入標(biāo)準(zhǔn):在胰島素抵抗基礎(chǔ)上，空腹血糖≥16.7 mmol/L。符合模型的28只做核素胃排空測定。

1.2.2 胃排空的檢測方法 分別于造模24 w、4 w時采用SPECT技術(shù)檢測胃排空功能。大鼠禁食8 h、禁水6 h后，應(yīng)用含有放射性核素標(biāo)記的半固體食物1 ml(由1 ml純牛奶與0.5 g面粉配制成糊劑〔2〕)，通過灌胃器緩慢注入胃內(nèi)之后立即將大鼠仰臥綁縛于特制固定架上，以大鼠腹部為目標(biāo)區(qū)(窗寬20%，矩陣128×128，放大倍數(shù)30)，以目標(biāo)區(qū)作為感興趣區(qū)行放射性活性采集，前半小時每5 min采集1次，然后每10 min采集1次，共采集9次，連續(xù)測定60 min。通過隨機軟件，計算出各項指標(biāo)的校正值及胃的排空曲線。在放射性活性采集期間間斷給予乙醚麻醉。A組為DM 24 w(DM-24)，B組為24 w對照組(NC-24)，C組為4 wDM組(DM-4)，D組為4 w對照組(NC-4)。見圖1。

1.2.3 取樣及指標(biāo)檢測 4 w時隨機取DM大鼠及正常對照組大鼠各12只檢測空腹血糖，做核素胃排空檢測，乙醚麻醉，開胸，心臟取血(6±2)ml，4℃自然凝固后，3 000 r/min離心10 min，取血清，檢測FINS、血內(nèi)皮素(ET-1)、血管性假性血友病因子(vWF)、血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)、血脂;取全胃，胃組織沿胃大彎剪開用生理鹽水沖洗后，展開平鋪于固定板固定后放入10%中性甲醛固定液中，于固定1 w內(nèi)分別取近端和遠端大小約0.4 cm ×2.0 cm胃組織，石蠟包埋，檢測胃組織血管形態(tài)和數(shù)據(jù)變化;取腹主動脈膈下0.5 cm至腎動脈分叉處以上1 cm處，長(1.4±0.1)cm血管放入10%中性甲醛固定液中，固定后截取0.2 cm血管，剩余的縱向剖開均用伊紅標(biāo)記后石蠟包埋，檢測管徑/管腔。24 w處理同前。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件處理。正態(tài)分布的計量資料描述用±s表示。多組間均數(shù)比較采用多因素方差分析，計量數(shù)據(jù)間的相關(guān)關(guān)系采用多因素逐步回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 胃排空動態(tài)變化 各組大鼠胃排空動態(tài)變化其中與對照組相比A組胃排空顯著減慢，而C組大鼠胃排空顯著增快，整個病程中DM胃排空變化呈先加快再逐漸減慢的過程。見表1。

2.2 各組大鼠胃組織血管形態(tài)和數(shù)量的變化 光鏡下HE染色:正常組大鼠胃組織微血管無擴張，管徑粗細均一，基底膜厚度正常，間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰;A組大鼠微血管擴張，基底膜明顯增厚，血管內(nèi)皮腫脹;小血管管徑粗細不一，部分血管呈囊樣擴張，漿膜層小血管管壁增厚，管腔變形、狹窄，基底膜增厚。C組無明顯變化。以胃底漿膜層小血管為統(tǒng)一納入標(biāo)準(zhǔn)做圖像分析。見圖2。

表1 各組大鼠胃排空動態(tài)變化的比較(±s)

表1 各組大鼠胃排空動態(tài)變化的比較(±s)

與同期組相比:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與C組比較:3)P＜0.01，4)P ＜0.05，下表同

組別 n 半排時間(min) 排空速率(%) 殘留率(55 min)A組 8 79.48±29.831)3) 0.64±0.342)3) 63.10±20.154)B組 12 47.79±13.21 1.13±0.33 46.50±19.00 C組 12 22.62±2.692) 2.20±0.242) 14.22±5.322)D組12 48.76±22.06 1.13±0.39 44.44±19.87

圖1 大鼠胃組織血管形態(tài)(HE，×200)

圖2 A組大鼠胃組織血管與神經(jīng)(M asson，×200)

光鏡下Masson染色:A組小血管周圍纖維化。管壁增厚，管壁中膜肌間膠原纖維增生，膠原蛋白交聯(lián)增多。管腔狹窄，內(nèi)膜損傷，不完整，部分內(nèi)皮細胞脫落。并且見胃底漿膜層神經(jīng)被囊增厚，神經(jīng)纖維有輕度纖維化。C組無明顯變化。見圖3。

免疫組化顯色:顯微鏡下血管內(nèi)皮細胞被染成黃色和黃棕色，以細胞質(zhì)及細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色著色者為陽性細胞，按文獻方法〔3〕以CD34的表達來標(biāo)記血管內(nèi)皮細胞，凡是染成棕黃色單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇均作為一個血管計數(shù)，凡管腔大于8個紅細胞大小、帶有較厚肌層的血管區(qū)域的血管均不計數(shù)。CD34陽性表達即微血管密度A組低于B組，C組略高于D組，隨著病程的進展，胃組織微血管密度呈先增多后減少的趨勢，管徑/管腔比值A(chǔ)組明顯增大，其他組別無明顯變化，說明供應(yīng)胃組織血流的小血管早期并無變化，晚期管壁增厚，管腔狹窄。見表2，圖3。

2.4 各組大鼠血管內(nèi)皮功能、血糖和體重及變化的比較 見表3。DM胃輕癱組vWF因子高于同期對照組;TM顯著高于同期對照組，并且隨著病程的發(fā)展，血漿TM逐漸增多，與早期糖尿病大鼠比較有統(tǒng)計學(xué)意義;血ET-1沒有明顯變化;血糖明顯高于同期對照組，體重隨著病程進展逐漸下降。

圖3 大鼠胃組織CD34+免疫組化顯色(DAB，×200)

表2 各組大鼠胃組織血管數(shù)量及管徑/管腔比值比較(±s)

表2 各組大鼠胃組織血管數(shù)量及管徑/管腔比值比較(±s)

組別 n CD34(%) 管徑/管腔比值A(chǔ)組 28 2.50±0.211)3) 3.21±0.271)3)B組 12 5.91±0.33 2.01±0.14 C組 12 8.74±0.541) 1.92±0.11 D組12 6.12±0.36 1.86±0.09

表3 各組大鼠血管內(nèi)皮功能血糖及體重動態(tài)變化的比較(±s)

表3 各組大鼠血管內(nèi)皮功能血糖及體重動態(tài)變化的比較(±s)

與同期對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;病程前后比較:3)P＜0.01

組別 n 內(nèi)皮功能(ng/ml)vWF TM ET-1 血糖(mmol/L)體重(g)A組28 4.61±2.692)3.27±0.691)3)0.49±0.31 18.6±1.221)312±381)3)0±33 B組12 2.35±0.32 1.73±0.41 0.27±0.18 4.0±0.35 392±31 C組12 3.11±0.802) 2.52±0.652)0.35±0.32 21.2±2.941)385±431)D組12 0.93±0.49 1.57±0.52 0.16±0.10 3.7±0.27 28

2.5 胃半排空時間與影響因素的多元逐步回歸分析 結(jié)果顯示與胃排空相關(guān)為 CD34(β=0.58，P=0.02)、TM(β=0.53，P=0.04)、vWF(β=0.32，P=0.05)?；貧w方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.513。

3 討論

目前認為糖尿病性胃輕癱(DGP)與自主神經(jīng)病變、腸神經(jīng)系統(tǒng)的病變、高血糖、胃腸激素、幽門螺旋桿菌、微血管病變等有關(guān)〔4〕。其中血管病變和DGP的關(guān)系較少受到人們的重視。血管病變是2型DM死亡和致殘的主要原因，也是許多并發(fā)癥的基礎(chǔ)。內(nèi)皮細胞損傷是DM血管病變的一個重要原因，也是動脈粥樣硬化的早期表現(xiàn)。內(nèi)皮細胞作為組織與血液之間的防線，是許多疾病發(fā)生的主要環(huán)節(jié)。von Willebrand因子(vWF)被認為是內(nèi)皮細胞損傷及功能障礙的標(biāo)志物〔5〕。vWF從血管內(nèi)皮釋放并沉積在基底膜上，與血小板質(zhì)膜上的受體結(jié)合介導(dǎo)血小板黏附于內(nèi)膜下基質(zhì)，增加微血栓形成的可能。TM也是血管內(nèi)皮損傷的一個分子標(biāo)記物。內(nèi)皮細胞一旦損傷會造成內(nèi)皮細胞參與凝血與纖溶能力的改變，從而導(dǎo)致高凝狀態(tài)，甚至血栓形成。而微血栓形成勢必加劇血管內(nèi)皮細胞的損傷。這些微血管病變正是DM患者腎臟、眼底、神經(jīng)、肌肉等特征性病變的基礎(chǔ)，它在DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

2004年Ceriello教授提出“共同土壤”學(xué)說〔5〕認為DM和血管病變有著共同的發(fā)病基礎(chǔ)-即氧化應(yīng)激損傷胰島細胞，同時損傷內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致DM和DM血管病變的發(fā)生。本實驗通過研究發(fā)現(xiàn)DM胃動力障礙和微血管病變有很大的相關(guān)性，而且很可能是DGP發(fā)病的始動因素。胃微血管變化較胃局部神經(jīng)變化出現(xiàn)早，胃動力障礙并未發(fā)生時微血管變化即存在，早期血管內(nèi)皮細胞損害，而且微血管代償性增加，胃動力加快。隨著病程進展，血管內(nèi)皮損害進一步加重，胃黏膜微血管逐漸減少，黏膜下及肌層小血管管壁增厚，管腔狹窄。毛細血管擴張管腔變大。小血管內(nèi)膜損傷不完整、小血管周圍有不同程度纖維化，管壁增厚，管壁肌間膠原纖維增生。早期未見明顯的神經(jīng)變化，整個DM病程中持續(xù)高血糖，血糖的波動和胃動力加快減慢未見直接相關(guān)性。

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4 王 平.糖尿病胃輕癱的研究新進展〔J〕.北京醫(yī)學(xué)，2007;29(5):304-5.

5 Ceriello A，Motz E.Is oxidative stress the pathogenicmechanism underlying insulin resistance，diabetes，and cardiovascular disease?The common soil hypothesis revisited〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(5):816-23.

R31;R587

A

1005-9202(2011)12-2260-03

2009年甘肅省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目(GSWST09-04)

嚴(yán) 祥(1952-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事老年醫(yī)學(xué)臨床和研究工作。

張喜娟(1981-)，女，在讀碩士，主要從事老年醫(yī)學(xué)胃腸動力學(xué)研究。

〔2009-12-21收稿 2010-06-11修回〕

(編輯 張永貴/曹夢園)