蒺藜皂苷對老年癡呆小鼠腦組織中H2 O2、CAT、GSH-Px含量及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響

張 季 嚴春臨 張丹參 張 力 安 芳 侯 勇 (河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

蒺藜皂苷對老年癡呆小鼠腦組織中H2O2、CAT、GSH-Px含量及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響

張 季 嚴春臨 張丹參 張 力 安 芳 侯 勇 (河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

目的 研究蒺藜皂苷對凝聚態(tài)β-淀粉樣肽(Aβ25～35)致衰老小鼠腦組織中過氧化氫(H2O2)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-Px)含量及海馬超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 采用一次性小鼠右側(cè)腦室注射Aβ25～353μl造成AD小鼠模型，并于側(cè)腦室注射后14 d測定各組小鼠腦組織中H2O2的含量、CAT、GSH-Px的活力并于光鏡、電鏡下觀察小鼠大腦皮質(zhì)及海馬組織超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 側(cè)腦室注射Aβ25～353μl后可引起小鼠腦組織內(nèi)H2O2含量增加，同時使小鼠腦組織內(nèi)CAT和GSH-Px活力顯著降低，而連續(xù)蒺藜皂苷14 d治療后，與模型組相比蒺藜皂苷150 mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05)，蒺藜皂苷450 mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px的活性(P＜0.01);光鏡下觀察結(jié)果顯示正常對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常;模型組神經(jīng)元間隙加大，說明有輕度水腫，部分神經(jīng)元核、質(zhì)界限模糊，細胞嗜酸性增強;電鏡下觀察結(jié)果顯示正常對照組神經(jīng)元、神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)正常;模型組神經(jīng)元輕度水腫，脂褐素樣包含物增多，線粒體減少或消失;蒺藜皂苷各治療組可不同程度的減輕上述病理學(xué)改變。結(jié)論 側(cè)腦室注射Aβ25～35可引起小鼠大腦自由基增加，海馬超微結(jié)構(gòu)改變，蒺藜皂苷能明顯改善衰老小鼠大腦組織的超微結(jié)構(gòu)并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。

蒺藜皂苷;阿爾茨海默病;β-淀粉樣肽;自由基;超微結(jié)構(gòu)

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要病理特征為大腦萎縮、腦組織內(nèi)出現(xiàn)老年斑(SP)、腦血管沉淀物、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和神經(jīng)元的丟失〔1〕。近年，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)β-淀粉樣肽(Aβ)在腦內(nèi)沉積形成SP是AD的發(fā)病基礎(chǔ)〔2〕。蒺藜皂苷(GSTT)是蒺藜果實中提取的甾體皂苷的總稱，GSTT具有治療心腦血管疾病、增強性功能、清除自由基等作用〔3，4〕。近期研究表明 GSTT 對 Aβ25～35所導(dǎo)致癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用〔5〕，GSTT是否通過清除癡呆小鼠腦內(nèi)多余自由基起作用，是否能改善癡呆小鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)病變目前均尚未見報道。本研究采用一次性在小鼠右側(cè)腦室注射3μl Aβ25～35造成AD小鼠模型，觀察癡呆小鼠腦內(nèi)自由基的變化及海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的改變，初步探討GSTT治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康、昆明種雄性小鼠，體重(28±2)g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。全部動物在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后用于實驗，分籠飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。室溫(20±2)℃。

1.1.2 藥品與試劑 GSTT購自西安天一生物技術(shù)有限公司，批號T20060901，含量90.12%，GSTT為棕黃色粉末，可溶于水，用前用蒸餾水配制成所需濃度。Aβ25～35購自美國Sigma公司，批號 29H49501，凝聚態(tài) Aβ25～35的制備:將 1.0 mg Aβ25～35溶解于1.0 ml的無菌生理鹽水中(1.0 mmol/L)，密封后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 w，使其成凝聚態(tài)，于 －20℃保存，備用〔6，7〕。過氧化氫酶(CAT)試劑盒、過氧化氫(H2O2)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。戊二醛、鋨酸、環(huán)氧樹脂(Epon-812)、甲基鈉迪克酸酐(MNA)等均為化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 昆明種雄性小鼠75只，隨機為5組，分別為生理鹽水對照組(正常對照組);Aβ(模型組);GSTT 50、150和450 mg/kg組。模型組和GSTT各治療組于小鼠右側(cè)腦室一次性注射Aβ25～353.0μl(3 nmol)，正常對照組注入等量生理鹽水〔8，9〕。于造模后1 h給藥，GSTT各治療組腹腔注射相應(yīng)劑量的GSTT(0.1 m l/10 g);正常對照組及模型組0.1 m l/10 g生理鹽水(NS)，每日1次，共14 d。

1.2.2 小鼠腦組織生化指標的測定 第14天給藥后1 h將小鼠迅速斷頭處死，取腦，制成10%腦勻漿，然后將制備好的腦勻漿以3 000 r/min離心10 min，取上清液適量，按照試劑盒說明書分別測定H2O2的含量、CAT、GSH-Px的活力，采用考馬斯亮藍法測定腦組織蛋白含量。

1.2.3 病理實驗 另取50只健康、昆明種雄性小鼠，體重(28±2)g，分組、給藥同前，第14天給藥后1 h將小鼠快速斷頭處死，在生理鹽水冰塊上迅速打開顱骨取腦，將腦膜和小腦剝離，保留大腦，用冷生理鹽水沖洗，用于光鏡和電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，結(jié)果以±s表示，組間顯著性差異采用單因素方差檢驗。

2 結(jié)果

2.1 GSTT對 Aβ25～35所致小鼠腦組織 H2O2含量、CAT和GSH-Px活力的影響 側(cè)腦室注射Aβ25～353μl后可引起小鼠腦組織內(nèi)H2O2含量增加，同時使小鼠腦組織內(nèi)CAT和GSH-Px活力顯著降低，而連續(xù)GSTT 14 d治療后，與模型組相比GSTT 50 mg/kg降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性無顯著性差異(P＞0.05)。GSTT 150 mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05)，GSTT 450mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px的活性(P＜0.01)。見表1。

2.2 GSTT對Aβ25～35所致小鼠腦組織神經(jīng)病理形態(tài)的影響光鏡觀察石蠟切片HE染色正常對照組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密集，由4～6層神經(jīng)細胞組成，神經(jīng)元核圓形，核仁大而清晰，異染色質(zhì)少，胞質(zhì)較少，突起不明顯;模型組神經(jīng)元間隙加大，說明有輕度水腫，部分神經(jīng)元核、質(zhì)界限模糊，細胞嗜酸性增強;GSTT各治療組神經(jīng)元水腫減輕，細胞邊界清晰。見圖1。

電鏡觀察正常對照組神經(jīng)元核大、圓，核仁多，核膜清晰，核間隙均勻，異染色質(zhì)少，常染色質(zhì)呈絮狀，胞質(zhì)中有豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等，未見脂褐素樣次級溶酶體，有髓神經(jīng)纖維，髓鞘結(jié)構(gòu)清晰;模型組神經(jīng)元輕度水腫，局部質(zhì)膜消失，核內(nèi)異染色質(zhì)相對增多，核仁少，電子密度降低，胞質(zhì)中細胞器減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張呈不規(guī)則泡狀，脂褐素樣包含物增多，線粒體減少或消失;GSTT 50 mg/kg治療組細胞核有不規(guī)則的凹陷，胞質(zhì)中細胞器增多，脂褐素仍較常見;GSTT 150 mg/kg治療組核仁可見，核邊界稍有不規(guī)則，細胞器增多;GSTT 450 mg/kg治療組神經(jīng)元核大、圓，核仁明顯，邊界清晰，細胞器豐富，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體均可見到，有的細胞中仍有脂褐素顆粒，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)正常。見圖2。

圖1 光鏡下，各組的超微結(jié)構(gòu)(HE染色，×100)

圖2 電鏡下，各組的超微結(jié)構(gòu)(釉-鉛染色，×10 000)

表1 GSTT對Aβ25～35模型小鼠腦組織H 2O2含量和CAT、GSH-Px活性的影響(±s，n=15)

表1 GSTT對Aβ25～35模型小鼠腦組織H 2O2含量和CAT、GSH-Px活性的影響(±s，n=15)

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)H2O2(mmol/L)CAT(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)正常對照組1.03±0.24 6.15±1.26 31.51±5.72模型組 1.33±0.251) 4.58±1.171) 22.77±5.641)GSTT組 50 1.23±0.18 4.64±1.32 24.28±4.77 GSTT組 150 1.14±0.212) 5.49±1.192) 27.33±5.732)GSTT組 450 1.09±0.193) 5.88±1.213) 29.36±5.583)

3 討論

AD最主要的病理改變?yōu)镾P和NFT，神經(jīng)細胞淀粉樣前體蛋白(APP)可在γ-分泌酶作用下裂解產(chǎn)生Aβ，Aβ是引起腦組織形成不溶性淀粉樣沉積的重要物質(zhì)，也是腦組織淀粉樣斑塊中的主要成分，側(cè)腦室內(nèi)一次性注射可溶性大片段Aβ可部分的模擬出AD臨床表現(xiàn)〔7〕。Aβ增高不但能引起斑塊沉積，Aβ亦具很強的陽性物質(zhì)還原作用，可迅速還原Ca2+和Fe2+，捕獲分子氧，產(chǎn)生H2O2，導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)，使超氧化物歧化酶(SOD)降低，丙二醛(MDA)上調(diào)，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞的凋亡或死亡〔8〕。過氧化物又可使溶解狀態(tài)下Aβ的轉(zhuǎn)化為聚集態(tài)的Aβ，加速腦內(nèi)的沉積和纏結(jié)，從而形成惡性循環(huán)〔9〕。本實驗結(jié)果表明模型組AD小鼠腦組織內(nèi)H2O2含量明顯升高，對小鼠造成一定的損傷，而GSTT可有效對抗小鼠腦內(nèi)H2O2升高，其機制可能與GSTT減少淀粉樣沉積、加速斑塊的清除、提高AD小鼠腦內(nèi)各種過氧化物酶(如CAT、GSH-Px)的活力，降低小鼠腦內(nèi)各種自由基，從而減少Aβ25～35所誘導(dǎo)的自由基損傷和細胞毒作用有關(guān)有關(guān)，GSTT對AD小鼠的保護作用是否與其他過氧化物酶活力提高有關(guān)，還有待進一步研究。本實驗還觀察到:GSTT 50 mg/kg和150 mg/kg劑量組對海馬神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)的保護作用均不明顯;GSTT 450 mg/kg組對海馬超微結(jié)構(gòu)顯示出明顯的保護作用。GSTT各組隨劑量增加，對海馬超微結(jié)構(gòu)的保護作用增強。因此GSTT能保護Aβ老化模型小鼠海馬超微結(jié)構(gòu)的正常，其作用可能通過清除自由基或增強自由基清除酶的活性，抑制膜脂質(zhì)過氧化機制起到保護海馬神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)的作用，從而達到延緩衰老和防治老年性癡呆，因此GSTT有可能成為治療AD的一種新藥，有廣泛的應(yīng)用前景。

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R965.1

A

1005-9202(2011)12-2258-03

張丹參(1961-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)藥理學(xué)研究。

張 季(1978-)，女，碩士，講師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

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〔2010-06-29收稿 2011-01-04修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)