GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒確證實驗

周密，韋帆，唐濤，張韓秋，王成權(quán)

(蕪湖市公安局刑警支隊，安徽蕪湖241000)

GoldeneyeTMDNA ID System 20A是基點認知技術(shù)(北京)有限公司研發(fā)的熒光STR復合擴增試劑盒，它可以同時檢測19個STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338、FGA)和一個性別位點Amelogenin。為了測試GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒的技術(shù)性能指標，評估其法醫(yī)學應用能力，本實驗室依據(jù)我國DNA檢驗的實際情況和要求，同時參照美國DNA分析方法專家組(TWGDAM)制定的確證指南[1]，從方法學驗證、靈敏度測試、混合樣本測試、批量樣本測試、DNA提取方法適應性測試、各類常見檢材的測試、穩(wěn)定性測試等7個方面制定了對GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒的測試方案[2～6]，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑9700型PCR擴增儀(ABI公司，USA);3130XL遺傳分析儀(ABI公司，USA);GoldeneyeTMDNA ID System 20A(基點認知技術(shù)公司，北京)。

1.2 實驗操作除方法學驗證外，其他實驗均參照試劑盒提供的使用說明書進行。

1.3 方法學驗證

1.3.1 熱啟動酶用量分別以0.5、1、2 U用量的熱啟動酶對125 pg的9947A標準品進行檢驗并重復一次。

1.3.2 退火溫度分別設(shè)置退火溫度為56、58、60、62、64℃，對125 pg的9947A標準品進行檢驗并重復一次。

1.3.3 擴增體系分別采用5、10、25 μl的擴增體系，對125 pg的9947A標準品進行檢驗并重復一次。

1.3.4 擴增循環(huán)次數(shù)分別設(shè)置熱循環(huán)次數(shù)為26、28、30、32、34，對125 pg的9947A標準品進行檢驗并重復一次。

1.3.5 引物量分別以0.5×、1×、2×引物量對125 pg的9947A標準品進行檢驗并重復一次。

1.4 靈敏度測試取9947A標準品，分別以500 pg、250 pg、125 pg、62.5 pg、31.25 pg的模板量進行檢驗并重復一次。

1.5 混合樣本測試取9947A和007標準品，分別定量后按19∶1、9∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶9、1∶19的比例混合，依次編為1～9號，各取1ng進行檢驗。

1.6 批量樣本測試對100個打拐建庫樣本進行擴增檢測，并重復擴增檢測一次。檢驗過程中采用自動化工作站提取、自動加樣。

1.7 DNA提取方法適應性測試分別對樣本采用Chelex-100、磁珠法、硅珠法、直接擴增法等方法進行擴增檢驗。

1.8 各類檢材的測試提取血痕、精斑、唾液斑(煙蒂)、肌肉或肋軟骨或骨骼DNA(每類8份、共32份檢材)進行擴增檢驗。

1.9 試劑穩(wěn)定性測試將GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒中的5×20A引物混合物、Allelic Ladder和內(nèi)標進行反復凍融，在凍融5、10、15、20次后進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 方法學驗證結(jié)果

2.1.1 熱啟動酶用量當熱啟動酶用量分別為0.5、1、2 U時，125 pg的9947A擴增均得到分型一致的結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失的情況，峰值在800～5 000 RFU之間，空白對照樣本正常，未觀察到非特異峰，部分基因座出現(xiàn)的Stutter峰均在主峰的10%以下，見圖1。

2.1.2 退火溫度分別以退火溫度56℃、58℃、60℃、62℃、64℃進行擴增，均得到分型一致的結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失的情況，峰值在500～4 000 RFU之間，空白對照樣本正常，未觀察到非特異峰，部分基因座出現(xiàn)的Stutter峰均在主峰的10%以下，見圖2。

2.1.3 擴增體系不同擴增體系進行擴增，均得到分型一致的結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失的情況，空白對照樣本正常，未觀察到非特異峰，部分基因座出現(xiàn)的Stutter峰均在主峰的10%以下。5 μl擴增體系峰值在100～2 000 RFU之間，10 μl擴增體系峰值在800～5 000 RFU之間，25 μl擴增體系峰值在200～1 500 RFU之間，見圖3。

2.1.4 擴增循環(huán)次數(shù)隨著擴增循環(huán)次數(shù)增加，擴增信號有增強的趨勢。當使用26、28次循環(huán)時，部分基因座擴增不完全。30次循環(huán)擴增峰值在200～2 000之間，32次循環(huán)擴增峰值在1 000～8 000之間，34次循環(huán)擴增峰值在2 000～10 000之間。34次擴增信號過強出現(xiàn)滲透峰?？瞻讓φ諛颖菊?。30、32、34次循環(huán)擴增均得到分型一致的結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失的情況。部分基因座出現(xiàn)的Stutter峰均在主峰的10%以下，見圖4。

2.1.5 引物量當引物量分別為0.5×、1×、2×時均得到分型一致的結(jié)果，未出現(xiàn)等位基因丟失的現(xiàn)象?？瞻讓φ諛颖菊?，未觀察到非特異峰，部分基因座出現(xiàn)的Stutter峰均在主峰的10%以下。0.5×引物用量時峰值在100～2 000 RFU之間，1×引物用量時峰值在100～2 000 RFU之間，2×引物用量時峰值在100～2 000 RFU之間，見圖5。

2.2 靈敏度測試分別使用500 pg、250 pg、125 pg、62.5 pg、31.25 pg的模板量的9947A標準品，以及30循環(huán)和32循環(huán)進行平行檢驗，得位點檢測成功率，見圖6。由圖6可得，30循環(huán)和32循環(huán)下，62.5 pg組和31.25 pg組均未得到完整電泳圖譜，該試劑盒的檢測靈敏度均為125 pg。

2.3 混合樣本測試GoldeneyeTMDNA ID System 20A檢驗9947A，007兩者在混合分型中呈現(xiàn)的均衡度、遞減、遞增趨勢與其在混合樣本中的比例基本相符，見圖7?；旌媳壤?∶1和1∶5之間時，超過90%的次要位點可成功檢測到;當混合比例在9∶1和1∶9之間時，超過80%的次要位點可成功檢測到;當混合比例達到19∶1和1∶19時，大約有58%的次要位點可檢測到。

2.4 批量樣本測試100個建庫樣本在各次檢測中均獲得完整清晰的圖譜和穩(wěn)定的分型結(jié)果。通過對100個建庫樣本進行統(tǒng)計分析，GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒的stutter峰高在各個基因座均在主峰的10%以下，見圖8。

2.5 DNA提取方法和各類檢材適應性測試Chelex-100、磁珠法、硅珠法、直接擴增法等4種方法提取10份血痕樣本和10份口腔拭子樣本擴增后檢測，均獲得完整的分型結(jié)果，未檢見等位基因丟失現(xiàn)象。直接擴增法檢測血痕和口腔拭子檢驗結(jié)果見圖9。對各類案件常見檢材如血痕、煙蒂、唾液斑、肋軟骨等樣本均獲得完整圖譜。

2.6 穩(wěn)定性測試經(jīng)過連續(xù)反復5、10、15、20次凍融檢驗結(jié)果之間沒有明顯變化。GoldeneyeTMDNA ID System 20A連續(xù)反復凍融20次的檢驗結(jié)果，見圖10。

3 討論

本文檢測結(jié)果顯示，GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒對常見案件檢材具有很好的檢測能力，對不同DNA提取方法有很好的適應性，具有較高的檢測靈敏度(125 pg)，且大批量樣本穩(wěn)定性高，抗凍融性能好。該試劑盒在所測試的各項性能指標已經(jīng)達到了國際同類產(chǎn)品的技術(shù)水平，可用于法庭科學的檢案與建庫。

GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒同時檢測19個STR基因座和1個性別基因座，包含Amp-FlSTR?Identifiler(ABI Corporation)、AmpFlSTR?Sinofiler(ABI Corporation)、Power Plex?16 HS(Promega Corporation)3個試劑盒的所有基因座[7～9]，相當于3種試劑盒聯(lián)合應用，具有較高的個體識別率和非父排除率。在DNA實驗室日常應用中，“19+1”試劑盒通常足夠DNA實驗室絕大部分親緣鑒定的需要。因此該試劑盒特別適合親緣鑒定案件和被拐賣或失蹤兒童的數(shù)據(jù)庫建設(shè)。

GoldeneyeTMDNA ID System 20A試劑盒可應用直接擴增法。與PowerPlex?16 HS系統(tǒng)直接擴增[10，11]相比，該試劑盒在血樣、口腔拭子、煙蒂等最常見生物檢材中也可取得類似的有效分型結(jié)果，可適用于大批量樣本的數(shù)據(jù)庫建設(shè)。此外，結(jié)合該試劑盒在兩個體混合樣本不同混合比例的實驗性應用與各基因座stutter峰高平均百分比，對比profile plus試劑盒(ABI Corporation)的混合樣本分型[12，13]，該試劑盒在混合樣本中次要位點檢測成功率高，可較好地用于混合樣本等疑難檢材的分型。

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圖1 熱啟動酶用0.5、1、2 U 125 pg 9947A擴增結(jié)果(從上至下)

圖2 退火溫度分別為56℃、58℃、60℃、62℃、64℃時125 pg 9947A擴增結(jié)果(從上至下)

圖3 擴增體系分別為5 μl、10 μl、25 μl時125 pg 9947A擴增結(jié)果(從上至下)

圖4 擴增次數(shù)26、28、30、32、34 125 pg9947A擴增結(jié)果(從上至下)

圖5 引物量分別為0.5×、1×、2×時125 pg 9947A檢驗結(jié)果(從上至下)

圖6 GoldeneyeTMDNA ID System 20A靈敏度檢測結(jié)果

圖7 混合樣本分析

圖8 各基因座stutter峰高平均百分比