動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法與21世紀(jì)毒性測(cè)試發(fā)展策略

郭家彬，彭雙清

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071)

隨著人們對(duì)動(dòng)物保護(hù)與動(dòng)物福利的關(guān)注和重視以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用“3R”原則在全球范圍內(nèi)的廣泛倡導(dǎo)與實(shí)施，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)受到越來(lái)越嚴(yán)格的限制。另一方面，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的快速發(fā)展，化學(xué)物質(zhì)等有害因素暴露的種類及數(shù)量日益增多，亟待進(jìn)行毒性測(cè)試與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。傳統(tǒng)的毒性測(cè)試主要依賴于大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、花費(fèi)大，且由于種屬差異等原因而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果在預(yù)測(cè)人體毒性風(fēng)險(xiǎn)時(shí)存在較大的不確定性，已經(jīng)難以滿足化學(xué)物質(zhì)等有害因素的評(píng)價(jià)需求。近年來(lái)，采用體外試驗(yàn)、低等生物和非生物載體等技術(shù)方法替代傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已成為外源性化合物毒性測(cè)試的重要發(fā)展方向，并在毒理學(xué)領(lǐng)域獲得快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，逐步形成了具鮮明特色的替代毒理學(xué)這一分支學(xué)科［1］。替代毒理學(xué)就是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法在毒理學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用，滲透了“3R”原則的全部?jī)?nèi)容，它不僅是動(dòng)物保護(hù)與動(dòng)物福利考慮的需要，也是毒理學(xué)學(xué)科發(fā)展以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要與科學(xué)要求。

1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的概述

1.1 “3R”原則與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法

早在1959年英國(guó)動(dòng)物學(xué)家Russell和微生物學(xué)家Burch在其著作《人道主義實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理》中首次系統(tǒng)地提出了“3R”原則，其核心內(nèi)容即指減少(reduction)、替代(rep lacement)和優(yōu)化(refinement)?！?R”原則旨在促進(jìn)科學(xué)、合理、人道地使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在保證實(shí)驗(yàn)科學(xué)性的前提下盡可能地減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用、減輕或消除動(dòng)物痛苦，著力提高動(dòng)物福利?！?R”原則自提出以來(lái)，受到歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)的高度重視，得到政府管理部門、學(xué)者和民間越來(lái)越廣泛的支持。歐盟、美國(guó)和日本等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)已制定相關(guān)法律法規(guī)以加強(qiáng)“3R”原則的貫徹實(shí)施。我國(guó)在2006年由國(guó)家科技部發(fā)布了《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，明確指出動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循“3R”原則。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的內(nèi)涵

“替代”是“3R”原則的核心內(nèi)容之一。廣義而言，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法就是指采用新的技術(shù)方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的或舊的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，任何一種能夠減少動(dòng)物使用和/或減輕動(dòng)物痛苦、提高動(dòng)物福利的方法都可視為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代的基本方法主要包括［2］，①應(yīng)用體外試驗(yàn)替代整體動(dòng)物試驗(yàn)，如體外培養(yǎng)的動(dòng)物或人源細(xì)胞、組織和器官等，細(xì)胞系和人組織標(biāo)本等；②應(yīng)用低等生物和有限知覺(jué)的生物體替代脊椎動(dòng)物試驗(yàn)，如植物、細(xì)菌、果蠅和斑馬魚(yú)等；③應(yīng)用數(shù)學(xué)、物理和化學(xué)技術(shù)方法和計(jì)算機(jī)模型等非生物手段，如利用結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系(SAR)模型預(yù)測(cè)化合物的潛在生物學(xué)效應(yīng)。從替代的層次和目的而言，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法可分為減少性替代、替代性研究和優(yōu)化性替代。減少性替代是指在保證獲得等同信息甚至更多有用信息的條件下，采用新的替代方法以減少動(dòng)物使用數(shù)量和/或縮短動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)間。如在藥物急性毒性試驗(yàn)中，采用上下法既能獲得動(dòng)物半數(shù)致死劑量值(LD50)，又能大大減少動(dòng)物使用數(shù)量。替代性研究主要是指采用無(wú)脊椎動(dòng)物或非動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手段替代脊椎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化性替代主要是指在動(dòng)物飼養(yǎng)、管理和/或試驗(yàn)過(guò)程中，采用新的技術(shù)方法進(jìn)行優(yōu)化完善，著力提高實(shí)驗(yàn)規(guī)范化水平和動(dòng)物福利。因此，從某種程度上而言，替代從不同層面和不同角度涵蓋了“3R”原則的所有內(nèi)容。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的建立、驗(yàn)證與管理認(rèn)可

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法是基于科學(xué)實(shí)驗(yàn)的需求以及動(dòng)物保護(hù)與動(dòng)物福利的充分考慮而設(shè)計(jì)的。一種新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法首先必須具有一定的科學(xué)性、可靠性、有效性、可操作性和經(jīng)濟(jì)性以及應(yīng)用價(jià)值，與現(xiàn)行的動(dòng)物試驗(yàn)方法有較好的相關(guān)性和一致性，其結(jié)果能夠較好地預(yù)測(cè)受試物的體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)［3］。在應(yīng)用新的試驗(yàn)方法替代傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須對(duì)該方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿?yàn)證研究，以證明新方法的可信性和相關(guān)性符合特定目的，即對(duì)替代法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證是基于某一特定目的，依據(jù)科學(xué)的程序而評(píng)價(jià)和確定新方法的可信性和相關(guān)性的過(guò)程?？尚判允侵冈诓煌瑫r(shí)間、不同實(shí)驗(yàn)室之間檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。相關(guān)性是指基于特定目的，某種方法或試驗(yàn)系統(tǒng)的科學(xué)基礎(chǔ)和相關(guān)模型的預(yù)測(cè)能力，它反映替代法的科學(xué)意義和適用性。替代法經(jīng)驗(yàn)證成功后遞交給管理機(jī)構(gòu)進(jìn)行審核、批準(zhǔn)，這一過(guò)程即為管理認(rèn)可。歐盟、美國(guó)、德國(guó)、日本、荷蘭、澳大利亞等國(guó)家和地區(qū)已經(jīng)建立了專門的機(jī)構(gòu)開(kāi)展替代方法的建立、驗(yàn)證和管理等工作，如歐洲替代法驗(yàn)證中心(ECVAM)、美國(guó)替代方法驗(yàn)證協(xié)調(diào)委員會(huì)(ICCVAM)、德國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法評(píng)價(jià)研究中心(ZEBET)、日本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法學(xué)會(huì)(JSAAE)和荷蘭國(guó)家替代法研究中心(NCA)等。截至2011年7月，已有69種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法獲得了經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)等組織的管理認(rèn)可［4］。我國(guó)替代法研究起步較晚，目前尚未建立專門的替代法驗(yàn)證與管理認(rèn)可機(jī)構(gòu)。

2 21世紀(jì)毒性測(cè)試面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)

當(dāng)前，食品和藥品安全、環(huán)境污染和職業(yè)衛(wèi)生等已成為國(guó)際和我國(guó)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展所面臨的重大問(wèn)題。特別是在我國(guó)，近年來(lái)食品和藥品安全事件以及環(huán)境污染等問(wèn)題十分突出，嚴(yán)重影響著我國(guó)居民的身心健康和經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。評(píng)價(jià)外源性化學(xué)物質(zhì)及物理性和生物性等有害因素對(duì)生物體，特別是人體產(chǎn)生的危害及其毒性作用機(jī)制是毒理學(xué)學(xué)科的主要任務(wù)。對(duì)外源性化合物或其它有害因素進(jìn)行毒性測(cè)試，是評(píng)估這些有害因素暴露風(fēng)險(xiǎn)的基礎(chǔ)。然而，在過(guò)去近40年期間，毒理學(xué)的核心測(cè)試試驗(yàn)方法幾乎沒(méi)有發(fā)生改變［5］。如何對(duì)迅速增長(zhǎng)的化學(xué)物等有害因素進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的毒性測(cè)試已經(jīng)成為21世紀(jì)毒理學(xué)發(fā)展所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

首先，新老化學(xué)物暴露急劇增加，毒性測(cè)試任務(wù)十分艱巨。以歐盟為例，年產(chǎn)量為1～100噸的化學(xué)物就超過(guò)30，000種，而人們僅對(duì)其中少數(shù)化學(xué)品獲知其毒理學(xué)特征［6］。據(jù)估計(jì)，超過(guò)86%的化合物缺乏系統(tǒng)的毒理學(xué)數(shù)據(jù)。隨著組合化學(xué)等技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，每天還有大量的新化學(xué)物形成，有待進(jìn)行毒性測(cè)試和暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。而高昂的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)費(fèi)用、冗長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)周期嚴(yán)重制約毒性測(cè)試的快速發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界平均每年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)花費(fèi)近140億美元，其中近30億用于毒理學(xué)試驗(yàn)。平均一個(gè)化合物的毒性測(cè)試周期為3.5年；其次，由于動(dòng)物種屬和個(gè)體差異，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ碗y以反映真實(shí)的人體反應(yīng)。盡管人們熟知?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)的局限性，但對(duì)于動(dòng)物模型的準(zhǔn)確性卻鮮有報(bào)道。有研究表明，在能引起兔子發(fā)生皮膚刺激反應(yīng)的化合物中僅有40%可在人體中引發(fā)類似反應(yīng)［7］。類似地，一項(xiàng)國(guó)際驗(yàn)證試驗(yàn)表明，化合物在大鼠中的半數(shù)致死劑量(LD50)值與人體血液中的致死劑量相關(guān)性并不好(相關(guān)系數(shù)僅為0.56)［8］。值得注意的是，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所采用的動(dòng)物多為遺傳背景相同、均一性的動(dòng)物或特定的動(dòng)物模型，而實(shí)際接觸化合物的人群則有可能千差萬(wàn)別；再次，在傳統(tǒng)的毒性測(cè)試中，為了更好地暴露化合物的潛在毒性，所采用的劑量常常遠(yuǎn)高于人體中的實(shí)際暴露劑量，而且試驗(yàn)所檢測(cè)的毒理學(xué)終點(diǎn)與評(píng)價(jià)指標(biāo)可能也與臨床人體試驗(yàn)存在較大差異。因此，這些毒性測(cè)試試驗(yàn)結(jié)果在預(yù)測(cè)人體毒性時(shí)很容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性錯(cuò)誤。

2006年12月18日，歐盟議會(huì)和歐盟理事會(huì)正式共同通過(guò)了化學(xué)品新政策的法規(guī)草案《關(guān)于化學(xué)品注冊(cè)、評(píng)估、許可和限制》，簡(jiǎn)稱REACH法規(guī)。依照《REACH法規(guī)》規(guī)定，自2009年3月11日起，在歐盟范圍內(nèi)禁止用動(dòng)物進(jìn)行化妝品急性毒性、眼刺激性和過(guò)敏性試驗(yàn)；2013年將禁止用動(dòng)物進(jìn)行慢性毒性、生殖毒性和毒物代謝動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)、美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)等部門近年來(lái)也頒布了多部相關(guān)管理法規(guī)和技術(shù)指南，明確要求或推薦采用體外試驗(yàn)以替代傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)。這些法律法規(guī)的實(shí)施為動(dòng)物保護(hù)和動(dòng)物福利提供了有力保障，有些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法還將成為毒性測(cè)試的必然選擇。

3 基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的毒性測(cè)試策略-毒理學(xué)替代法

毒理學(xué)是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用最為廣泛的學(xué)科之一。近年來(lái)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代法越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外毒理學(xué)工作者的關(guān)注和重視，并在毒理學(xué)領(lǐng)域獲得快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，逐步形成了基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法的毒性測(cè)試新策略，即毒理學(xué)替代法。在毒理學(xué)領(lǐng)域，任何能夠優(yōu)化動(dòng)物使用(如減輕或消除動(dòng)物痛苦)、減少動(dòng)物使用、采用非動(dòng)物檢測(cè)系統(tǒng)(如體外培養(yǎng)的細(xì)胞、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)模型)或低等動(dòng)物(如魚(yú)、昆蟲(chóng)類)等技術(shù)方法開(kāi)展的試驗(yàn)都可視為毒理學(xué)替代法，納入替代毒理學(xué)的研究范疇［1］。毒理學(xué)替代法是“3R”原則在毒理學(xué)學(xué)科中的具體實(shí)踐與應(yīng)用。無(wú)論是從毒理學(xué)學(xué)科的科學(xué)發(fā)展角度還是從經(jīng)濟(jì)角度考慮，毒理學(xué)替代法對(duì)外源性化學(xué)物的危害性評(píng)價(jià)及管理均具有重要的意義，在減少動(dòng)物使用、減少實(shí)驗(yàn)影響因素、縮短實(shí)驗(yàn)周期、降低實(shí)驗(yàn)成本、闡明毒性作用機(jī)制以及提高動(dòng)物福利等諸多方面都較傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)有著明顯的優(yōu)勢(shì)。

針對(duì)21世紀(jì)毒性測(cè)試與毒理學(xué)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)和前景展望，2007年美國(guó)國(guó)家研究院(NRC)發(fā)表了一份具有里程碑意義的報(bào)告，即《21世紀(jì)毒性測(cè)試：遠(yuǎn)景與策略》［9］。該報(bào)告為未來(lái)毒性測(cè)試的發(fā)展提供了十分重要的策略參考，突出強(qiáng)調(diào)21世紀(jì)毒性測(cè)試的重點(diǎn)將由整體動(dòng)物試驗(yàn)轉(zhuǎn)向基于人類細(xì)胞、細(xì)胞系和/或細(xì)胞組分等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法的測(cè)試策略。未來(lái)毒性測(cè)試的主要內(nèi)容包括化學(xué)物的特性分析、含毒性通路和靶向測(cè)試的毒性測(cè)試以及劑量-反應(yīng)與外推模型的研究，通過(guò)這些研究進(jìn)一步開(kāi)展外源性化合物的危險(xiǎn)度評(píng)價(jià)和人群與暴露資料的分析，如圖1所示。毒性測(cè)試的重點(diǎn)關(guān)注因素包括敏感檢測(cè)終點(diǎn)的選擇與評(píng)價(jià)、細(xì)胞-反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)、高通量與中通量方法的構(gòu)建與應(yīng)用、作用機(jī)制與作用模式、毒性通路以及系統(tǒng)生物學(xué)效應(yīng)等，著力實(shí)施高通量、高靈敏度、低成本、預(yù)測(cè)能力強(qiáng)而且準(zhǔn)確的毒性測(cè)試策略［9-11］。因此，未來(lái)的毒性預(yù)測(cè)將主要依賴于體外試驗(yàn)和基于計(jì)算機(jī)、數(shù)學(xué)等模型的非生物學(xué)試驗(yàn)，傳統(tǒng)動(dòng)物試驗(yàn)將可能被部分替代甚至完全替代。NRC這份報(bào)告自提出以來(lái)，引起了學(xué)術(shù)界、政府管理部門以及工業(yè)界等的強(qiáng)烈反響。美國(guó)EPA和國(guó)立衛(wèi)生研究院等機(jī)構(gòu)合作，迅速啟動(dòng)了一個(gè)重大研究計(jì)劃開(kāi)展相關(guān)研究。2011年3月，英國(guó)聯(lián)合利華公司在中國(guó)上海召開(kāi)了21世紀(jì)毒性測(cè)試策略研討會(huì)，積極尋求包括中國(guó)在內(nèi)的合作與交流。

圖1 NRC提出的21世紀(jì)毒性測(cè)試遠(yuǎn)景策略

4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法在毒理學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展與應(yīng)用

近年來(lái)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法在毒理學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展十分迅速。毒理學(xué)替代法已經(jīng)涵蓋了一般毒性、靶器官毒性、遺傳毒性、致癌性和局部毒性等多種毒性終點(diǎn)，研究手段與技術(shù)方法也從一般的組織細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展形成了成含基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)模擬和生物信息學(xué)等多學(xué)科、多層次的綜合評(píng)價(jià)體系［12］。毒理學(xué)替代法已被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于藥品、新化學(xué)物、食品添加劑、農(nóng)藥、消毒產(chǎn)品、生物制品、化妝品和日用品等的毒性測(cè)試，其中有些替代方法還通過(guò)了ECVAM等權(quán)威機(jī)構(gòu)的驗(yàn)證，并被歐盟和美國(guó)等國(guó)家和地區(qū)納入法規(guī)管理范圍。以下結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)開(kāi)展的研究工作，列舉部分毒理學(xué)替代法的研究進(jìn)展與應(yīng)用。

4.1 急性毒性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)對(duì)于評(píng)定化學(xué)物急性毒性效應(yīng)的強(qiáng)弱、確定致死劑量大小有著重要意義。急性毒性試驗(yàn)的動(dòng)物替代策略主要包括動(dòng)物減少性替代和體外試驗(yàn)替代。減少性替代方法仍然以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，但動(dòng)物數(shù)量比傳統(tǒng)急性毒性試驗(yàn)明顯減少。如固定劑量法、上下法、探測(cè)劑量法、累積劑量設(shè)計(jì)法、近似致死劑量法和限量試驗(yàn)等。這些替代方法均可有效地減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量。OECD已修訂發(fā)布了3種檢測(cè)經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)方法，包括急性毒性分級(jí)法、固定劑量法和上下法。研究表明，化學(xué)物體外細(xì)胞毒性與體內(nèi)急性毒性之間存在正相關(guān)性，因此可利用體外試驗(yàn)方法對(duì)體內(nèi)急性毒性進(jìn)行定量預(yù)測(cè)。目前常用的體外細(xì)胞毒性檢測(cè)方法有中性紅攝取法、噻唑蘭(MTT)法和乳酸酶漏出法等。本實(shí)驗(yàn)室采用MTT法檢測(cè)了多種抗病毒先導(dǎo)化合物的細(xì)胞毒性，并通過(guò)數(shù)學(xué)模型計(jì)算獲得其LD50預(yù)測(cè)值，結(jié)果顯示這些預(yù)測(cè)值與體內(nèi)試驗(yàn)獲得的LD50值相似［13，14］。目前，已有2種體外試驗(yàn)方法通過(guò)美國(guó)ICCVAM的驗(yàn)證并于2010年獲得OECD的管理認(rèn)可，另有多種替代方法尚處在驗(yàn)證階段［4］。

4.2 心血管毒性評(píng)價(jià)

心血管系統(tǒng)是許多外源性化合物毒性作用的重要靶器官。近年來(lái)，由心臟QT間期延長(zhǎng)而導(dǎo)致的心血管毒性事件已成為新藥研發(fā)失敗和已上市藥物撤市的主要原因之一。研究表明，QT間期延長(zhǎng)與心肌細(xì)胞HERG離子通道抑制密切相關(guān)。為了更好地發(fā)現(xiàn)藥物可能存在的心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)，ICH指導(dǎo)原則S7B推薦采用體外試驗(yàn)篩選候選化合物或受試藥物對(duì)HERG通道的作用，從而及時(shí)淘汰不適合繼續(xù)開(kāi)發(fā)的化合物或警示藥品存在心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)室采用轉(zhuǎn)染人 HERG離子通道的HEK293細(xì)胞系測(cè)試了三七總皂苷和黃楊寧等傳統(tǒng)中藥或其單體致心臟毒性的潛在風(fēng)險(xiǎn)［15，16］。此外，離體心臟模型、清醒動(dòng)物遙測(cè)等技術(shù)方法也獲得了管理機(jī)構(gòu)的認(rèn)可，很大程度上減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用并提高了心臟毒性測(cè)試的準(zhǔn)確性。

4.3 胚胎干細(xì)胞模型

由于胚胎干細(xì)胞(ESC)可以在體外無(wú)限擴(kuò)增并保持未分化狀態(tài)，還可定向誘導(dǎo)分化成各種功能細(xì)胞，因而在毒性篩選、毒性靶器官的確定以及毒性機(jī)制研究等方面具有獨(dú)特的巨大優(yōu)勢(shì)。作為一種新的毒性測(cè)試體外模型，其相關(guān)研究已成為21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重點(diǎn)課題。英國(guó)計(jì)劃在2006年～2015年期間投入3000萬(wàn)英鎊以建立基于ESC的體外毒性評(píng)價(jià)系統(tǒng)。葛蘭素史克、阿斯利康和羅氏等大型制藥公司也將ESC模型作為藥物毒性篩選的重要策略。人胚胎干細(xì)胞(hESC)直接來(lái)源于人體，因此其測(cè)試結(jié)果具有更好的預(yù)測(cè)價(jià)值，

最近研究提示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSC)在靶器官毒性評(píng)價(jià)中具有很好的應(yīng)用價(jià)值［17］。

4.4 模式動(dòng)物斑馬魚(yú)

斑馬魚(yú)(Danio rerio)是一種與人類基因同源性較高的新型模式動(dòng)物，其發(fā)育及細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制與哺乳動(dòng)物高度相似，且具有個(gè)體小、繁殖周期短、廉價(jià)易管理、胚胎透明可以直接觀察器官發(fā)育等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，斑馬魚(yú)已被廣泛用于環(huán)境毒性檢測(cè)、藥物早期高通量篩選等毒性測(cè)試中。針對(duì)斑馬魚(yú)在生態(tài)環(huán)境檢測(cè)中的應(yīng)用，OECD專門制定了一系列基于斑馬魚(yú)的毒性測(cè)試操作指南。本實(shí)驗(yàn)室采用斑馬魚(yú)評(píng)價(jià)了氯丙嗪、阿霉素、5-氟尿嘧啶和異煙肼等藥物以及鉛等環(huán)境污染物的毒性作用，均顯示出與哺乳動(dòng)物有良好的相關(guān)性，后期將開(kāi)展相關(guān)的驗(yàn)證試驗(yàn)以充分證明該模型的可信性和相關(guān)性。

4.5 毒理“組學(xué)”

隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等“組學(xué)”技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為從基因、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平全面系統(tǒng)地開(kāi)展毒性測(cè)試提供了有力的理論支持和方法學(xué)支撐，形成了毒理基因組學(xué)和毒理蛋白質(zhì)組學(xué)等新興交叉學(xué)科，為藥物和環(huán)境污染物等化學(xué)物的毒性評(píng)價(jià)提供重要工具。本實(shí)驗(yàn)室采用全基因掃描芯片技術(shù)以及“2D”電泳和飛行質(zhì)譜等蛋白學(xué)技術(shù)研究了異煙肼、利福平和阿霉素等藥物以及多氯聯(lián)苯等持久性污染物染毒后的基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)改變，為闡明這些毒物的毒性作用特征及其可能的作用機(jī)制，制定早期預(yù)測(cè)和治療藥物研發(fā)提供了重要參考［18-20］。

5 我國(guó)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法與毒性測(cè)試發(fā)展的思考和展望

我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法研究起步較晚，與歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)相比存在較大差距，目前毒性測(cè)試仍然以大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為主，以此外推對(duì)人體健康的可能危害與風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，雖然國(guó)內(nèi)有些實(shí)驗(yàn)室和學(xué)者在替代毒理學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行了一些有益嘗試和積極探索，但缺乏系統(tǒng)性的工作，且原創(chuàng)性研究較少，大部分毒理學(xué)替代法系參照或追蹤歐盟、美國(guó)和日本等國(guó)家和地區(qū)的一些方法。我國(guó)部分用于藥品、生物制品、化妝品、化學(xué)品以及農(nóng)藥等產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)的體外檢測(cè)技術(shù)方法基本是借鑒了OECD和美國(guó)FDA等國(guó)際機(jī)構(gòu)發(fā)布的技術(shù)指南，這在一定程度上促進(jìn)了我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法的研究和應(yīng)用與國(guó)際接軌，并為我國(guó)毒性測(cè)試體系的發(fā)展起到了積極的促進(jìn)作用。然而，由于我國(guó)尚未建立有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法的專門管理機(jī)構(gòu)，國(guó)內(nèi)相關(guān)工作呈自由分散狀態(tài)，應(yīng)用監(jiān)管存在缺失甚至空白，缺乏行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范，難以對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法進(jìn)行系統(tǒng)的研究、驗(yàn)證和管理認(rèn)可以及國(guó)際協(xié)調(diào)工作。從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法研究的專業(yè)人才短缺，科技投入相對(duì)不足，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法的應(yīng)用與推廣還有限。

值得欣喜的是，近年來(lái)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法研究得到我國(guó)政府和學(xué)者越來(lái)越多的關(guān)注和支持?！笆晃濉逼陂g，在國(guó)家科技部和衛(wèi)生部等部門的支持下，我國(guó)設(shè)立開(kāi)展了多項(xiàng)針對(duì)食品、藥品和農(nóng)藥等產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)的體外毒性檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究。這些項(xiàng)目的開(kāi)展對(duì)于建立形成我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法研究體系、推動(dòng)毒理學(xué)替代法在我國(guó)健康快速發(fā)展以及專業(yè)人才培養(yǎng)有著十分重要的意義。在國(guó)家支撐計(jì)劃、“國(guó)家重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)和國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的資助下，北京大學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和中國(guó)科學(xué)院等國(guó)內(nèi)高校和科研院所積極開(kāi)展了毒理學(xué)替代法的相關(guān)研究與推廣。2009年，我國(guó)學(xué)者出版了第一部有關(guān)替代毒理學(xué)的專著，即《毒理學(xué)替代法》，此后，還相繼出版了多部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法相關(guān)專著。已有越來(lái)越多的學(xué)者和單位積極呼吁我國(guó)應(yīng)盡早成立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法研究和管理的專門機(jī)構(gòu)，以規(guī)范我國(guó)替代法研究、驗(yàn)證和管理、加強(qiáng)國(guó)內(nèi)外合作與國(guó)際協(xié)調(diào)。可以預(yù)見(jiàn)的是，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代方法擁有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用前景，但同時(shí)也是我國(guó)毒理學(xué)和相關(guān)學(xué)科工作者面臨的一項(xiàng)任重而道遠(yuǎn)的艱巨任務(wù)。

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