土槿皮乙酸對(duì)肝癌 BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

李丹丹 李巖

土槿皮乙酸對(duì)肝癌 BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

李丹丹 李巖

目的 研究土槿皮乙酸對(duì)人肝癌 BEL-7402細(xì)胞株轉(zhuǎn)移能力的影響。方法 體外培養(yǎng)人肝癌 BEL-7402細(xì)胞株,用不同濃度 PAB及只用培養(yǎng)基(對(duì)照組)作用不同時(shí)間后,應(yīng)用 MTT法篩選最佳藥物濃度。通過(guò) Transwell檢測(cè) PAB對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果 土槿皮乙酸作用后肝癌細(xì)胞粘附率較對(duì)照組明顯下降(P＜0.05),并呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。土槿皮乙酸作用后遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組。結(jié)論 土槿皮乙酸能抑制肝癌細(xì)胞增殖,降低肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。

土槿皮乙酸;肝癌細(xì)胞;增殖;轉(zhuǎn)移

土槿皮乙酸(pseudorlaricacid-B,PAB)是從我國(guó)的松科植物金錢(qián)松的根皮及近根皮中分離出來(lái)的二萜類(lèi)化合物,為一種單體成分。研究證明 PAB可以抑制胃癌[1,2]、肝癌[3]、宮頸癌[4]白血病[5]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān) PAB對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)將探討 PAB對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響,以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療肝癌的新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株BEL-7402由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院傳染科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng),在含 10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液、飽和濕度,飽和溫度為 37℃,CO2濃度為 5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 材料 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco公司、胎牛血清購(gòu)自天津?yàn)笊镏破饭?噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自 Sigma公司;帶有 8μm微孔聚碳酸酯膜的 Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室購(gòu)于美國(guó) Costar公司。土槿皮乙酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110880。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 BEL-7402細(xì)胞,接種于用 96孔培養(yǎng)板中,每孔 100μl。實(shí)驗(yàn)組一組加 0.5μmol/L-1PAB分別培養(yǎng) 24、48、72h,另一組加入不同濃度的 PAB使其終濃度分別為 4、2、1、0.5μmol/L,培養(yǎng) 24 h。對(duì)照組加入 100μl含 10%胎牛血清的培養(yǎng)基,于上述培養(yǎng)時(shí)間后,加入濃度為 5g/L的 MTT20μl。繼續(xù)培養(yǎng) 4h后加 DMSO150μl,振蕩 10min后,用酶聯(lián)儀于 570nm處測(cè)出各孔吸光度值(OD),計(jì)算生長(zhǎng)抑制率,實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次。生長(zhǎng)抑制率 =[1-(處理組平均 OD值/對(duì)照組平均 OD值)]×100%。

1.4 Transwell檢測(cè) PAB對(duì) BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),打勻的細(xì)胞懸液加入 Transwell小室,同時(shí)加入 0.5μmol/L-1PAB,我選擇的 PAB濃度是用 MTT篩選出的 72h的 IC50,以血清濃度差作為趨化條件:小室內(nèi)為含 1%血清的培養(yǎng)基,下室為含 30%血清的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng) 24h后予甲醇固定,姬姆薩染色,取膜,封片,鏡檢。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)(±s)表示,采用 t檢驗(yàn),P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PAB對(duì) BEL-7402細(xì)胞增殖的影響 不同濃度 PAB(0.5,1.0,2.0,4.0)作用相同時(shí)間,隨著藥物濃度的增加,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率增加,相同濃度 PAB作用不同時(shí)間(24,48,48h),隨著時(shí)間的增加,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率增加。表現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性 0.5μmol/LPAB作用 24 h,對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。(表 1)

表 1 MTT法檢測(cè) PAB對(duì) Bel-7402細(xì)胞增殖的影響

2.2 PAB對(duì) BEL-7402細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 0.5μmol/LPAB組作用 24h后遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組,對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰,活力旺盛,PAB組細(xì)胞明顯變圓,稀疏。提示PAB對(duì)于肝癌BEL-7402細(xì)胞的遷移能力有明顯的抑制作用(見(jiàn)圖 1)。

圖 1 Transwell檢測(cè) PAB對(duì) BEL-7402細(xì)胞遷移的影響

3 討論

土槿乙酸傳統(tǒng)上是作為一種抗真菌藥物,后來(lái)發(fā)現(xiàn)其具有抗生育、抗血管生成和抗腫瘤作用。研究證明 PAB可以抑制胃癌[1,2]、肺癌、肝癌[3]、宮頸癌[4]白血病[5]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,但尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)PAB對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)土槿皮乙酸作用后肝癌細(xì)胞粘附率、轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯下降(P＜0.05),并呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。土槿皮乙酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,其作用機(jī)制可能與清除氧自由基,作用于細(xì)胞周期集細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶,影響 p53、Bcl-2家族、Caspase激活[6],影響與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路等有關(guān)。

PAB具有明確的抑制血管生成作用,血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是最具有效性和特異性的誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生成的因子[7],是多種抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)。2004年 TanWF等的研究顯示 PAB可以阻止 VEGF誘導(dǎo)的KDR磷酸化,但是并不影響 KDR的總蛋白水平。另外 PAB也降低了 Akt和ERK的磷酸化[8]。土槿皮乙酸有效劑量?jī)?nèi)并未觀察到毒性反應(yīng),通過(guò)用BALB/C-nu祼鼠進(jìn)行活體肝腫瘤藥敏試驗(yàn)顯示:PAB對(duì)腫廇的抑制呈劑量依賴(lài)性,25mg/(kg·d)的劑量可以被動(dòng)物耐受,且沒(méi)有毒性表現(xiàn)和體質(zhì)量減輕現(xiàn)象[9]。

綜上所述,土槿皮乙酸對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡[3]確實(shí)有影響,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土槿皮乙酸對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移能力有抑制作用,但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)治療肝癌的新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

[1] 徐永紅,王學(xué)清,鞠曉華,等.土槿皮乙酸誘導(dǎo)人胃癌 SGC7901細(xì)胞凋亡及機(jī)制,中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2008,24(5):601-606.

[2] Meng AG,Jiang LL.JAsian Nat Prod Res.Pseudolaric acid B-induced apoptosis through p53-dependent pathway in human gastric carcinoma cells,2009,11(2):142-152.

[3] 鞠曉華,徐永紅,李巖.土槿皮乙酸對(duì) BEL-7402細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位及 COX-2蛋白表達(dá)的影響.世界華人消化雜志,2008,4,16(11):1151-1156.

[4] 任姿,方莉,沈宏偉.土槿皮乙酸作用 PI3K/Akt通路誘導(dǎo) HeLa細(xì)胞凋亡.中山大學(xué)學(xué)報(bào),2008,16(2)355406-0659-05

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110004中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院