復(fù)合益生菌的研制及應(yīng)用

楊智敏 劉愛(ài)玲 趙風(fēng)琴

（河南省洛陽(yáng)市洛龍區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，洛陽(yáng) 471022）

復(fù)合益生菌的研制及應(yīng)用

楊智敏 劉愛(ài)玲 趙風(fēng)琴

（河南省洛陽(yáng)市洛龍區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，洛陽(yáng) 471022）

選擇30只50日齡、體重在0.5～0.75 kg的斷奶肉仔兔，設(shè)1個(gè)試驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組，完全隨機(jī)分組，試驗(yàn)期為60 d。試驗(yàn)組基礎(chǔ)日糧中添加一定劑量本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的復(fù)合益生菌，對(duì)照組按常規(guī)方法飼養(yǎng)，測(cè)定日增重、增重率、日耗料、料肉比及機(jī)體免疫狀況等指標(biāo)。試驗(yàn)期結(jié)束，對(duì)試驗(yàn)兔心臟采血，以玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測(cè)兔血液中T淋巴細(xì)胞的玫瑰花環(huán)形成率和酯酶染色試驗(yàn)檢測(cè)血液中T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。以試管凝集反應(yīng)檢測(cè)大腸桿菌抗體含量。試驗(yàn)結(jié)果表明：試驗(yàn)組平均增重（1.01 kg）高于對(duì)照組（0.74 kg）（P＜0.05），試驗(yàn)組的增重率（2.76%）比對(duì)照組（2.20%）升高0.56%。試驗(yàn)組斷奶仔兔血液中T淋巴細(xì)胞的玫瑰花環(huán)形成率在85.10%，遠(yuǎn)高于對(duì)照組的玫瑰花環(huán)形成率69.06%。試驗(yàn)組斷奶仔兔血液循環(huán)中T淋巴細(xì)胞數(shù)目（397個(gè)）比對(duì)照組（329個(gè)）高出20.67%。試驗(yàn)組兔體內(nèi)抗大腸桿菌抗體比對(duì)照組高出400倍。由以上結(jié)果可知在斷奶仔兔的日糧中添加復(fù)合益生菌能夠顯著的提高生產(chǎn)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，對(duì)促進(jìn)生長(zhǎng)、降低料肉比、提高飼料利用率等指標(biāo)有較好的效果。

復(fù)合益生菌 斷奶仔兔 免疫力 日增重 飼料利用率

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 蛋白胨，酵母浸膏，NaCl，牛肉提取物，葡萄糖，乙酸鈉，檸檬酸二胺，吐溫-80，磷酸氫二鉀，七水硫酸鎂，一水硫酸錳，碳酸鈣，瓊脂。

1.1.2 染色液 革蘭氏染色液：草酸銨結(jié)晶紫染色液、碘液、95%酒精、堿性美蘭。

1.1.3 生化反應(yīng)管 均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 電熱恒溫培養(yǎng)箱；超凈工作臺(tái)；高壓蒸汽消毒器；電動(dòng)離心機(jī)；光學(xué)顯微鏡；電子天平；接種環(huán)；試管；平皿；冰箱等。

1.1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 家兔30只購(gòu)于洛陽(yáng)市白馬寺。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌的分離與鑒定

1.2.1.1 產(chǎn)芽孢菌的篩選 在無(wú)菌條件下，取5 g枯草加入到盛有45 ml無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩混勻，懸浮液于80℃下保持10 min，以殺死非芽孢的菌體。取5 ml懸浮液接入到裝有45 ml種子培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，于37 ℃富集培養(yǎng)20 h。取富集培養(yǎng)后的菌液，用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋?zhuān)∫欢客坎加谄桨?，?7 ℃下培養(yǎng)20 h。挑選生長(zhǎng)良好、菌落較大的單菌落接種于斜面保藏培養(yǎng)基中，冰箱4 ℃保藏。

1.2.1.2 產(chǎn)芽孢菌的初步鑒定 樣品經(jīng)過(guò)上述處理后，篩選出1株產(chǎn)芽孢菌，37 ℃下培養(yǎng)20 h，通過(guò)格蘭氏染色、鏡檢對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 其他菌的分離與鑒定 植物乳桿菌、戊糖片球菌、地衣芽孢桿菌菌種來(lái)自于河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。先分別將三種菌接種于MRS液體培養(yǎng)基復(fù)活，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，分別取少量放于平皿上，格蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌的活性、形態(tài)及是否有雜菌。

1.2.3 復(fù)合益生菌的培養(yǎng) 在確定4種菌存活及生長(zhǎng)良好后，分別將其接種于MRS固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后，觀察菌落形態(tài)及是否有雜菌生長(zhǎng)。之后，分別將其接種于MRS液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)。

1.2.4 復(fù)合益生菌的鑒定 對(duì)4種菌先進(jìn)行形態(tài)觀察，之后進(jìn)行染色特性，菌落特性鑒定，最后通過(guò)生化反應(yīng)結(jié)果并依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》來(lái)確定細(xì)菌。生化反應(yīng)包括：V-P測(cè)定、接觸酶反應(yīng)、水解反應(yīng)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原、吲哚反應(yīng)、檸檬酸反應(yīng)等。

1.2.5 復(fù)合益生菌的增菌 將培養(yǎng)好的復(fù)合益生菌用MRS液體培養(yǎng)基增菌。

1.2.6 飼糧配方 試驗(yàn)所用的基礎(chǔ)日糧配方：豆柏，菜籽柏，棉籽柏，魚(yú)粉，草粉，飼料級(jí)磷酸氫鈣，食鹽，飼料級(jí)蛋氨酸，賴(lài)氨酸，飼料級(jí)維生素（VA、VD3、VE、VK3、VC、VB2、VB12），氯化膽堿等。復(fù)合益生菌內(nèi)含有4種益生菌包括植物乳桿菌、戊糖片球菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，有效的菌群數(shù)保證>10億個(gè)/g左右。

1.2.7 飼喂方法

1.2.7.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選擇日齡，體重相近的斷奶肉仔兔共30只，隨機(jī)2組（不分公母），對(duì)照組10只，試驗(yàn)組20只。

1.2.7.2 飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)兔室內(nèi)籠養(yǎng)，兔籠為單個(gè)式。每籠面積0.35 m2（0.5×0.7），對(duì)照組籠中10只，試驗(yàn)組籠中20只。兔舍自然通風(fēng)，每天定時(shí)打掃衛(wèi)生和清理糞便一次，碗式飲水器，料槽，自由飲水和自由采食顆粒飼料（計(jì)量）。試驗(yàn)前按常規(guī)疫苗程序進(jìn)行免疫，試驗(yàn)期間每7天稱(chēng)1次體重（空腹），最后計(jì)算日增重率和飼料消化率等指標(biāo)。

1.2.7.3 測(cè)定項(xiàng)目及分析方法 試驗(yàn)始、末重，實(shí)驗(yàn)期間每周稱(chēng)1次體重，每天記錄凈采食量，觀察記錄兔群腹瀉發(fā)病，死亡情況。使用Excel處理文章重出現(xiàn)的數(shù)據(jù)。

1.2.7.4 飼喂方法 試驗(yàn)組兔子基礎(chǔ)日糧與對(duì)照組相同，在飼喂復(fù)合益生菌時(shí)我們采取了以下方法：

飲水飼喂：控制好細(xì)菌的飼喂量，直接用增菌的MRS液體培養(yǎng)基讓其飲水。

拌料飼喂：將增菌的MRS液體培養(yǎng)基以3000轉(zhuǎn)∕min的速度離心8 min，取沉淀物拌于飼料中飼喂。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體免疫狀況檢測(cè)

1.3.1 玫瑰花環(huán)形成試驗(yàn)

1.3.1.1 試劑配制

① Hanks液：

原液甲：氯化鈉160.0 g，氯化鉀8.0 g，7水合硫酸鎂2.0 g，6水合氯化鎂2.0 g，溶于800 ml雙蒸餾水中；氯化鈣2.0 g，溶于100 ml雙蒸餾水中。將上述2液混合后，加蒸餾水至1000 ml，用濾紙過(guò)濾，加入2.0 ml氯仿作為防腐劑，保存于4 ℃。

原液乙：12水合磷酸氫二鈉3.04 g，磷酸二氫鉀1.2 g，葡萄糖20.0 g溶于800 ml雙蒸餾水中；稱(chēng)取0.4 g苯酚紅于研缽中，漸漸加入0.1N氫氧化鈉并不斷研磨，直至所有顆粒完全溶解，所加入氫氧化鈉的量為11.28 ml，最后加蒸餾水至100 ml。

將上述2液混合，加雙蒸餾水至1 000 ml用濾紙過(guò)濾，加氯仿2.0 ml，保存4 ℃冰箱。使用時(shí)，取原液甲、乙各25 ml，加蒸餾水至500 ml充分混合，以9磅10 min高壓滅菌。用前用5%的碳酸氫鈉溶液pH值于7.0。

②0.5%的乳白蛋白水解物的配制（乳漢液）：

稱(chēng)1 g乳白蛋白水解物，溶于200 ml Hanks液中，9磅10 min高壓滅菌，保存于4 ℃冰箱備用。

③抗菌素配制（簡(jiǎn)稱(chēng)SP液或雙抗液）：

取水劑青霉素100萬(wàn)單位，鏈霉素1.0 g，溶于100 ml Hanks液中，低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

④5%的碳酸氫鈉溶液配制：

稱(chēng)取碳酸氫鈉5 g，溶于100 ml蒸餾水中，瓶口用膠塞塞緊，防止漏氣，10磅10 min高壓滅菌，保存于4 ℃冰箱備用。

⑤3.8%枸櫞酸納溶液的配制：

稱(chēng)取枸櫞酸納1.9 g，溶于蒸餾水50 ml，10磅10 min高壓滅菌，保存于4 ℃冰箱。

⑥紅細(xì)胞保存液（阿氏液）的配制：

稱(chēng)取葡萄糖2.46 g，2水合檸檬酸鈉0.96 g，氯化鈉0.504 g，蒸餾水100 ml，各成分在蒸餾水中溶解后，加入5%檸檬酸鈉約12 ml，調(diào)pH值于6.1，10磅10 min高壓滅菌，保存于4 ℃冰箱備用。

⑦ 細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液的配制：

用0.5%的乳漢液18 ml，臨用時(shí)加20%的犢牛血清，再加入雙抗0.3 ml，用5%的碳酸氫鈉溶液調(diào)pH值至7.0。

1.3.1.2 玫瑰花環(huán)的檢查方法 綿羊紅細(xì)胞的配制：自綿羊靜脈采血，儲(chǔ)存于等量阿氏液中，置4 ℃冰箱中可保存1個(gè)月，臨用時(shí)吸取保存液底部的紅細(xì)胞放入離心管中，用生理鹽水或Hanks液洗滌3次（室溫1500轉(zhuǎn)/分離心10 min），最后用細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液配成1%～5%紅細(xì)胞懸液。

①用1個(gè)試管，先加入3 ml 淋巴細(xì)胞分層液（分層液由商品供應(yīng)）。

②在此分層液液面上輕輕加入4～5 ml肉兔抗凝血（千萬(wàn)不要打破2液間的液面）。

③用1500～2000轉(zhuǎn)/分離心10～20 min，此時(shí)可見(jiàn)液面分4層：上層為血漿，第2層為淋巴細(xì)胞，第3層為淋巴細(xì)胞分層液，最后為紅細(xì)胞粒細(xì)胞。

④用吸管直插入淋巴細(xì)胞層吸取淋巴細(xì)胞放入含有Hanks液4～5 ml的試管中，充分混勻1500～2000轉(zhuǎn)/分離心5～10 min（洗兩次）。棄去上清液，即獲得純淋巴細(xì)胞。

⑤吸取上述淋巴細(xì)胞懸液0.1 ml，加入犢牛血清0.1 ml及5%綿羊紅細(xì)胞懸液0.2 ml，混勻后置于37 ℃溫箱中5 min，其間搖動(dòng)2～3次。500轉(zhuǎn)/分離心5 min，4 ℃置于冰箱2個(gè)小時(shí)或過(guò)夜。

⑥取出標(biāo)本輕輕旋轉(zhuǎn)混勻（注意不可甩動(dòng)，以免花環(huán)脫落），沿管壁加入0.8%戊二醛一滴，再輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，置4 ℃冰箱20 min。500轉(zhuǎn)/分離心5 min，棄上清液，將沉淀物混勻后推片。滴加瑞士顏色液（或革蘭氏染液）1～2滴，在再加pH6.4的磷酸緩沖液，染5 min。

1.3.1.3 結(jié)果觀察 用油鏡或高倍鏡檢查，凡淋巴細(xì)胞表面粘貼4個(gè)以上的綿羊紅細(xì)胞為陽(yáng)性花環(huán)形成細(xì)胞，檢查300個(gè)以上淋巴細(xì)胞，計(jì)算出花環(huán)細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的百分比。

1.3.2 酯酶染色法

1.3.2.1 試劑配制

① 固定液：（福爾馬林—丙酮酸緩沖液）

磷酸氫二鈉20 mg，磷酸二氫鉀100 mg，雙蒸餾水30 ml，丙酮40 ml，40%的甲醛25 ml，充分混勻后溶解過(guò)濾，置4 ℃冰箱備用。

②染色液

⑴染色液副品紅溶液：副品紅4 g加入2N鹽酸100 ml 溶解過(guò)濾。

⑵1.6%的亞硝酸鈉溶液：4%的亞硝酸鈉1 g，加蒸餾水2.5 ml，臨用當(dāng)天配制。

⑶2% a-醋酸萘酯溶液：稱(chēng)取a-醋酸萘酯2 g，加入乙二醇甲醚100 ml，放有色試劑瓶中，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

⑷M/15 pH7.6磷酸鹽緩沖液：

甲液：磷酸二氫鉀9.08 g，加蒸餾水至1000 ml。

乙液：磷酸氫二鉀23.88 g，加蒸餾水至1000 ml。

取甲液13 ml，乙液87 ml，混合后即成。

⑸酯酶染色液的配制：吸取副品紅液3 ml于瓶中，再吸取4%亞硝酸鈉溶液3 ml，徐徐加入M/15 pH 7.6磷酸鹽緩沖液89 ml，用玻璃棒攪勻，再慢慢滴入加2% a-醋酸萘酯溶液2.5 ml，邊加邊攪拌，使顏色由乳白色變?yōu)榈鸦ㄉ鞚針尤芤?。調(diào)pH 為5.8。

⑹1%甲基綠液：稱(chēng)取甲基綠液1 g于量瓶中加蒸餾水至100 ml。

1.3.2.2 酯酶染色操作方法

①采血：兔子靜脈采血，作全血涂片、晾干、血片厚薄適宜。

②固定：將血片浸于福爾馬林-丙酮緩沖液中固定1 min，取出用自來(lái)水沖洗3 min，再經(jīng)蒸餾水洗后，干燥。（也可以不固定）。

③染色：將血片浸染于酯酶染色液中，37 ℃浸染1～3 h，取出后流水沖洗，晾至半干。

④復(fù)染：將血片標(biāo)本浸于1%甲基綠溶液中染色1 min，取出流水沖洗后，干燥。

⑤鏡檢：在油鏡下觀察，可見(jiàn)淋巴細(xì)胞質(zhì)中有褐紅色顆粒為T(mén)細(xì)胞，沒(méi)有褐紅色顆粒為B細(xì)胞，紅細(xì)胞呈淡黃色，單核細(xì)胞為粉紅色。

2.3.3 試管凝集反應(yīng)

①每份血清用6支試管（1 cm×8 cm）另取對(duì)照管3支，如待檢血清不多時(shí)，只設(shè)1份對(duì)照組。

②按表1用0.5%石碳酸生理鹽水，將被檢血清稀釋呈6個(gè)稀釋度，第7管中不加血清，設(shè)抗原對(duì)照。

③各管中加入用0.5%石碳酸生理鹽水稀釋20倍的大腸桿菌抗原0.5 ml（每升含升細(xì)菌8億個(gè)）。

④各管中加抗原后，充分混勻，放于37 ℃溫箱中4～10 h，取出后室溫放置18～24 h，然后觀察并記錄結(jié)果。見(jiàn)表1。

判斷結(jié)果時(shí)用“+”表示反應(yīng)強(qiáng)度：

表1 大腸桿菌凝集反應(yīng)

表2 枯草芽孢桿菌的主要生理生化特征

++++：液體完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底，振蕩時(shí)，沉淀物呈片狀（即100%的菌體被凝集）。

+++：液體略混濁，菌體大部分被凝于管底，振蕩時(shí)呈片狀顆粒狀（75%菌體被凝集）。

++：液體不透明，管底有明顯凝集片，振蕩時(shí)有塊狀或小片絮狀物（50%菌體被凝集）。

+：液體不透明，僅管底有少許凝集，其余無(wú)顯著的凝塊（25%菌體被凝集）。

-：液體混濁，管底無(wú)凝集，菌體不被凝集，但由于菌體自然下沉，在管底中央可見(jiàn)圓點(diǎn)狀沉淀，振蕩后立即散開(kāi)呈均勻混濁。

判定血清凝集價(jià)：出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度為凝集價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌的分離鑒定結(jié)果

2.1.1 枯草芽孢桿菌的初步鑒定結(jié)果 樣品經(jīng)過(guò)上述處理后，篩選出1株產(chǎn)芽孢菌，對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。37 ℃下培養(yǎng)20 h后，顯微鏡下觀察，革蘭氏染色陽(yáng)性，長(zhǎng)桿狀，以鏈狀排列，運(yùn)動(dòng)，芽孢中生或近中生，無(wú)莢膜，孢子囊不膨大。菌落圓形，直徑4～7 mm，表面皺褶，灰白色或微帶黃色，無(wú)光澤，放射狀，邊緣不整齊，葉狀，帶有鱗片，不透明。

2.1.2 枯草芽孢桿菌的生理生化鑒定結(jié)果（見(jiàn)表2）

2.2 地衣芽孢桿菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

2.2.1 地衣芽孢桿菌的初步鑒定結(jié)果 樣品經(jīng)過(guò)上述處理后，37 ℃下培養(yǎng)24 h后鏡檢，革蘭氏染色反應(yīng)為陽(yáng)性，菌體呈桿狀，側(cè)面平行，兩端鈍圓，長(zhǎng)約1.7～2 μm，寬約0.7～0.9 μm，芽孢橢圓形、近中生，芽孢囊不明顯膨大。

在MRS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落圓形，直徑2.8～4 mm，淺灰色、較薄、干燥、不透明、表面粗糙皺褶、邊緣較厚呈環(huán)狀隆起。菌落與培養(yǎng)基緊貼，不易挑取，挑入水滴時(shí)保持膜狀。

2.2.2 地衣芽孢桿菌的生理生化特性結(jié)果（見(jiàn)表3）

2.3 植物乳桿菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

將復(fù)活的植物乳桿菌接種于MRS固體培養(yǎng)基可見(jiàn)到灰白色、不透明、圓形、光滑、濕潤(rùn)的大菌落。鏡檢看到革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌種呈短桿狀，寬0.9～1.2 μm，長(zhǎng)2～6 μm，有時(shí)成對(duì)或成鏈狀，不產(chǎn)芽胞。其生化特性見(jiàn)表4。

表3 地衣芽孢桿菌的主要生理生化特征

表4 植物乳桿菌的生理生化特性

表5 戊糖片球菌的生理生化特性

表6 飼喂復(fù)合益生菌對(duì)肉兔生長(zhǎng)性能的影響

表7 復(fù)合益生菌對(duì)實(shí)驗(yàn)兔玫瑰花環(huán)形成率的影響

表8 復(fù)合益生菌對(duì)試驗(yàn)兔酯酶染色結(jié)果的影響

2.4 戊糖片球菌的分離培養(yǎng)結(jié)果

將復(fù)活的戊糖片球菌接種于MRS固體培養(yǎng)基，在30 ℃條件下培養(yǎng)2 d后可見(jiàn)到，其生長(zhǎng)良好，菌落四周有明顯的透明圈，菌落斜嵌于培養(yǎng)基內(nèi)的呈菱形，生長(zhǎng)在表面的呈規(guī)則的圓形，白色扁平。鏡檢看到菌株革蘭氏染色陽(yáng)性，經(jīng)亞甲藍(lán)單染色后與光學(xué)顯微鏡（1600×）下觀察，細(xì)胞球狀，四聯(lián)或成片狀排列，細(xì)胞直徑約1μm。其生化特性見(jiàn)表5。

2.5 復(fù)合益生菌對(duì)斷奶肉仔兔生產(chǎn)性能的影響（見(jiàn)表6）

由表可知：60 d試驗(yàn)期后，試驗(yàn)組的平均增重高于對(duì)照組，差異顯著（P＞0.05），試驗(yàn)組的日增重率比對(duì)照組高0.56%，試驗(yàn)組的料肉比低于對(duì)照組，說(shuō)明復(fù)合益生菌對(duì)促進(jìn)生長(zhǎng)、降低料肉比、提高飼料利用率等指標(biāo)有較好的效果。

2.6 玫瑰花環(huán)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（見(jiàn)表7）

圖1 玫瑰花環(huán)形成圖

由圖1和表7可知：試驗(yàn)組對(duì)T淋巴細(xì)胞玫瑰花環(huán)形成率高于對(duì)照組，說(shuō)明復(fù)合益生菌可以顯著的提高機(jī)體免疫力，能夠刺激腸道粘膜上的免疫細(xì)胞，從而增強(qiáng)腸道內(nèi)的免疫活力。

2.7 酯酶染色法的結(jié)果（見(jiàn)表8）

由表8及圖2可知：試驗(yàn)組的T細(xì)胞所占例比對(duì)照組提高了20.67%，T細(xì)胞明顯比對(duì)照組增多，從而可以增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，說(shuō)明復(fù)合益生菌能夠有效地提高免疫力。

2.8 試管凝集反應(yīng)的結(jié)果（見(jiàn)表9）

通過(guò)試管凝集反應(yīng)檢測(cè)出兔血清中的抗大腸桿菌抗體比對(duì)照組高出400倍。說(shuō)明復(fù)合益生菌在兔消化道粘膜上能夠刺激腸道內(nèi)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，增強(qiáng)抗病原微生物的功能。

3 討論與分析

3.1 培養(yǎng)條件對(duì)復(fù)合益生菌的影響

在益生菌生產(chǎn)的整個(gè)過(guò)程中，都要考慮到益生菌活性這一重要標(biāo)準(zhǔn)，以便達(dá)到并保持高活性。據(jù)報(bào)道，在發(fā)酵液中添加吐溫80或是鈣對(duì)冷凍過(guò)程中菌的存活有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)改善培養(yǎng)條件來(lái)影響益生菌菌種的活力，在MRS培養(yǎng)基中添加碳酸鈣和吐溫80以促進(jìn)菌種的存活。

3.2 復(fù)合益生菌的安全性

對(duì)于新篩選出的益生菌菌株進(jìn)行安全性檢測(cè)是非常必要的，只有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，確定其為安全性較高的菌株才可以用于生產(chǎn)使用。本實(shí)驗(yàn)的4種菌為地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、戊糖片球菌及枯草芽孢桿菌均為美國(guó)食品藥物管理局認(rèn)為安全的益生菌，能夠確保其安全性。

表9 試管凝集反應(yīng)的結(jié)果

3.3 復(fù)合益生菌的使用劑量

益生菌的益生作用是通過(guò)有益微生物在動(dòng)物體內(nèi)一系列生理活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其最終效果同使用的益生菌數(shù)量密切相關(guān)。若數(shù)量不夠，在體內(nèi)不能形成菌群優(yōu)勢(shì)，難以起到益生作用。曹建民等試驗(yàn)表明，如果一種細(xì)菌在盲腸內(nèi)容物的濃度低于107個(gè)/g，則該菌產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物不足以影響宿主；若數(shù)量過(guò)多，超出占據(jù)腸內(nèi)附著點(diǎn)和形成優(yōu)勢(shì)菌群所需的數(shù)量，非但功效不會(huì)增加，反而造成浪費(fèi)。目前，益生菌用于特定養(yǎng)殖動(dòng)物所需的菌群數(shù)量尚無(wú)統(tǒng)一的規(guī)定。瑞典規(guī)定乳酸菌制劑活菌數(shù)要達(dá)到2×1011個(gè)/g。我國(guó)正式批準(zhǔn)生產(chǎn)的制劑中，對(duì)含菌數(shù)量與用量的規(guī)定是：芽孢桿菌含量≥5×108個(gè)/g，乳酸桿菌≥107個(gè)/g，益生素的一般含量106～107個(gè)/g。本實(shí)驗(yàn)中飼喂時(shí)保證了有效的菌群數(shù)>10億個(gè)/g左右，能夠達(dá)到有效飼喂量。

3.4 復(fù)合益生菌的使用方法

本實(shí)驗(yàn)采取2種方法發(fā)現(xiàn)由于益生菌的難聞氣味，兔子會(huì)拒絕飲水，而離心后拌入飼料中的方法兔子更易于接受。除此還可以將復(fù)合益生菌裝入膠囊中以2粒∕天的形式飼喂，總之每種方法都有弊有利，我們?cè)谶x擇時(shí)應(yīng)根據(jù)實(shí)際條件去應(yīng)用。

圖2 酯酶染色結(jié)果

3.5 復(fù)合益生菌可以提高動(dòng)物生產(chǎn)性能

實(shí)驗(yàn)中觀察到，添加益生菌后的飼料適口性好，可刺激食欲，提高采食量。張紅軍等用2 000只蛋雞進(jìn)行了多株菌種的發(fā)酵飼料飼喂試驗(yàn)，試驗(yàn)組料蛋比顯著低于對(duì)照組；試驗(yàn)組產(chǎn)蛋率極顯著高于對(duì)照組；試驗(yàn)組蛋重極顯著高于對(duì)照組，并且使用發(fā)酵飼料降低了飼料成本。

3.6 復(fù)合益生菌可以改善環(huán)境

益生菌可以明顯降低飼養(yǎng)環(huán)境的氨氣、硫化氫、臭氧等有害氣體濃度．減少環(huán)境因素中的疫病誘因。益生菌的應(yīng)用可太大縮短病原菌在體內(nèi)的停留時(shí)間。雞在長(zhǎng)期攝入抗生素時(shí)，可以延長(zhǎng)糞便中沙門(mén)氏菌的排出過(guò)程，利用小鼠作的實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)，這是因?yàn)榭股匾种屏苏＞?，使沙門(mén)氏菌能得以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)存活繁殖?，F(xiàn)在有許多研究證明，一些益生菌制劑可以明顯減少環(huán)境中病原微生物的數(shù)量，減輕臭味等，這為創(chuàng)造一個(gè)清潔的環(huán)境提供了可行的方法。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)是對(duì)斷奶仔兔添加復(fù)合益生菌后生產(chǎn)性能及免疫力效果的研究。結(jié)果證明，復(fù)合益生菌可以在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，優(yōu)化動(dòng)物的健康狀況，從而提高生產(chǎn)性能。除此它還可以加快斷奶仔兔T淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和成熟，刺激機(jī)體免疫功能，減少死亡率，提高養(yǎng)殖效益。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓人們對(duì)復(fù)合益生菌的應(yīng)用效果又有了一個(gè)全面認(rèn)識(shí)，為復(fù)合益生菌的研究推廣與應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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