DNA聚合酶η蛋白表達(dá)差異與OVCR3細(xì)胞順鉑敏感性以及TP方案化療的卵巢上皮癌患者臨床療效相關(guān)性分析

曹麗芝，曾 勇，任華益，陳金燕

湖南省腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長(zhǎng)沙 410013

卵巢原發(fā)性惡性腫瘤中有60%～80%病理類型屬于上皮性卵巢癌。卵巢癌作為最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，由于其臨床發(fā)病隱匿，且缺乏特異性的早期發(fā)病指征，晚期卵巢癌患者生存率極低，僅達(dá)到25%左右[1-3]。目前，上皮性卵巢癌患者的預(yù)后以及生活質(zhì)量均無法得到很好的提升。20世紀(jì)90年代以來，多項(xiàng)大規(guī)模的臨床研究提示，采用紫杉醇聯(lián)合順鉑作為晚期卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案對(duì)于該類患者的治療具有及其重要的地位。但是，在上述聯(lián)合化療過程中，因?yàn)榛颊弑憩F(xiàn)的對(duì)鉑類藥物耐藥的現(xiàn)象導(dǎo)致療效不佳是眾多臨床學(xué)者無法回避的客觀事實(shí)。鉑類藥物作為一類卵巢癌的化療過程中最有效的細(xì)胞毒藥物，通過形成鉑-DNA絡(luò)合物，導(dǎo)致DNA致命性損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用[4-5]。鉑類藥物雖然耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，最新的研究已經(jīng)明確DNA損傷修復(fù)是其最主要的機(jī)制之一。在DNA的損傷修復(fù)過程中，DNA聚合酶發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其中聚合酶η起最關(guān)鍵的作用。DNA聚合酶通常分為經(jīng)典聚合酶以及跨損傷復(fù)制聚合酶兩種，跨損傷復(fù)制聚合酶尤其是聚合酶η蛋白能夠在細(xì)胞DNA受到損傷的情況下保證細(xì)胞的復(fù)制得以順利進(jìn)行，在保護(hù)細(xì)胞的同時(shí)也造成了耐藥現(xiàn)象的發(fā)生[6-8]。根據(jù)以上背景，筆者認(rèn)為從聚合酶η蛋白的表達(dá)情況出發(fā)，分別從基因、蛋白水平研究該聚合酶與順鉑藥物敏感性的關(guān)系，結(jié)合順鉑臨床療效的觀察，對(duì)于分析順鉑耐藥的機(jī)制有著積極的意義。本文在基礎(chǔ)研究水平，通過MTT法比較siRNA沉默目的基因前后OVCR3細(xì)胞對(duì)于鉑類藥物的敏感性，首先驗(yàn)證DNA聚合酶η蛋白與細(xì)胞順鉑敏感性的關(guān)系。同時(shí)，通過分析病理組織標(biāo)本中聚合酶η蛋白表達(dá)情況，觀察其與臨床資料的相關(guān)性。旨在從基礎(chǔ)以及臨床兩個(gè)水平分析聚合酶η蛋白在卵巢上皮癌順鉑耐藥過程中發(fā)揮的作用，為下一步攻克鉑類藥物耐藥現(xiàn)象提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 OVCR3細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞生化所。

1.1.2 病理組織來源 選取我院入院治療的卵巢上皮癌50例患者手術(shù)切除病理組織標(biāo)本?；颊吣挲g23～63歲，平均43.7歲。所有組織標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)為上皮性卵巢癌。上皮性卵巢癌按FIGO標(biāo)準(zhǔn)分期和組織學(xué)分級(jí)（GRADE）。

1.1.3 主要試劑 RNA干擾試劑盒 （Silencer TM siRNA Construction Kit）購自美國(guó)Ambion公司；陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine TM 2000購自Invitrogen公司；噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司）；RT-PCR 試劑盒購自 Sigma公司；目的蛋白鼠單克隆抗體為美國(guó)ADI抗體公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)DNA聚合酶η蛋白編碼基因序列以及siRNA設(shè)計(jì)原則，由啟始密碼子開始，選擇長(zhǎng)度為20個(gè)bp的候選序列為siRNA靶序列。通過Blast軟件進(jìn)行同源性分析，排除存在同源序列的靶序列，并最終確定3段長(zhǎng)度為21bp的基因序列為靶序列。靶序列的確定與引物合成由Sigma公司完成。

1.2.2 MTT法進(jìn)行耐藥性分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OVCR3細(xì)胞株接種于96孔板，每孔1×106/ml單細(xì)胞懸液，每孔接種90 μl，每組設(shè) 3 個(gè)復(fù)孔，加入不同濃度的順鉑（10 μmol/L，30 μmol/L，60 μmol/L），空白對(duì)照為細(xì)胞培養(yǎng)液，陰性對(duì)照為未處理的細(xì)胞懸液。培養(yǎng)48 h后加入5 mg/ml MTT溶液，每孔200 μl，孵育12 h后 加入DMSO 100 μl，搖勻10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定光密度D570 nm值。通過直線回歸法計(jì)算藥物的IC50。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)聚合酶η編碼基因表達(dá) 在6孔板中接種2×105/孔濃度的單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞培養(yǎng)至85%的覆蓋率時(shí)，使用Trizol提取總RNA，RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用引物擴(kuò)增目的基因。配置2.0%瓊脂糖凝膠，在120 V、25 min條件下對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖片的采集。

1.2.4 免疫染色及結(jié)果判定 4%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋后切片。使用1∶50濃度單抗工作液，采用S-P法染色，陽性著色部位在細(xì)胞核。應(yīng)用枸櫞酸鹽緩沖液（PH 6.0）以及加熱法進(jìn)行抗原修復(fù)。陽性定位于細(xì)胞核，鏡下見著棕黃色的細(xì)胞為陽性，從陽性表達(dá)強(qiáng)度和陽性表達(dá)率兩方面進(jìn)行雙盲法觀察與記分。染色強(qiáng)度分 4級(jí)：無表達(dá)為0分，可疑表達(dá)為1分，弱陽性表達(dá)為 2分，陽性表達(dá)為3分，強(qiáng)陽性表達(dá)為4分。表達(dá)陽性率按百分比分別記分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。最后得分為每個(gè)研究病例的染色強(qiáng)度和陽性百分?jǐn)?shù)相加數(shù)，最后分為3個(gè)級(jí)別：0～1 分為陰性（－），2～3 分為陽性（＋），4～5 分為強(qiáng)陽性（＋＋）。

1.3 臨床資料收集

收集患者住院號(hào)、姓名、年齡、住院時(shí)間、手術(shù)日期、術(shù)后評(píng)價(jià)、手術(shù)病理分期、腫瘤病理類型、腫瘤組織分化程度、術(shù)后至初次化療開始時(shí)間、化療方案、初次化療至復(fù)發(fā)的時(shí)間、化療療程、CA125水平變化等指標(biāo)。

1.4 療效判定標(biāo)準(zhǔn)

完全緩解（CR）：所有目標(biāo)病灶消失；部分緩解（PR）：病灶長(zhǎng)徑總和縮小≥30%；病情穩(wěn)定（SD）：病灶長(zhǎng)徑總和有縮小但未達(dá)到30%或者增加＜20%；疾病進(jìn)展（PD）：病灶長(zhǎng)徑總和增加＞20%。 有效率（RR）=完全緩解（CR）+部分緩解（PR）。

1.5 隨訪

入組通過電話方式進(jìn)行隨訪，了解患者的生存期以及是否同期進(jìn)行相關(guān)治療。患者從初次化療開始直至死亡或者是研究結(jié)束的時(shí)間間隔定義為生存期。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對(duì)OVCR3細(xì)胞DNA聚合酶η蛋白編碼基因表達(dá)的影響

采用Alpha Innotech軟件采集比較siRNA轉(zhuǎn)染前后，OVCR3細(xì)胞DNA聚合酶η蛋白編碼基因表達(dá)差異，結(jié)果顯示以30 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，目的基因表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），在 24 h 后下調(diào)（85.37±0.59）%。 見圖 1。

2.2 MTT法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后，OVCR3細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的改變

分別對(duì)對(duì)照組細(xì)胞以及siRNA處理后的細(xì)胞，通過酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值（OD值）。具體的藥物抑制率計(jì)算公式為：藥物抑制率＝（1-OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白對(duì)照/OD陰性對(duì)照-OD空白對(duì)照）×100%。結(jié)果顯示，不同濃度順鉑（10μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L） 對(duì) 對(duì) 照 組 細(xì) 胞 的 抑 制 率 分 別 為（35.27±0.98）%、（62.31±0.75）%、（79.26±0.88）%； 不同濃度順鉑（10 μmol/L、30 μmol/L、60 μmol/L）對(duì) siRNA 處理后細(xì)胞的抑制率分別為（57.15±0.64）%、（73.57±0.53）%、（88.19±0.55）%。通過擬合回歸直線，順鉑對(duì)兩組細(xì)胞的IC50分別為（46.66±2.23）μmol/L、（30.21±3.09）μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 DNA聚合酶η蛋白在卵巢癌組織中的表達(dá)

50例組織標(biāo)本中，DNA聚合酶η蛋白表達(dá)為強(qiáng)陽性標(biāo)本13例，占26.0%；陽性標(biāo)本25例，占50.0%；陰性標(biāo)本12例，占24%。見圖2-4。

2.4 DNA聚合酶η蛋白表達(dá)差異與TP方案治療患者近期療效的關(guān)系

50例共完成TP化療322個(gè)療程，平均每個(gè)患者6.44個(gè)療程?？傆行蕿?4.0%。其中，聚合酶表達(dá)強(qiáng)陽性組有效率為46.2%，陽性組有效率為64.0%，陰性組有效率為83.3%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

表1 不同DNA聚合酶表達(dá)含量組間TP方案治療近期療效比較（例）Tab.1 Short term effect of TP therapy strategy among the groups with different DNA polymerase expression(caes)

2.5 DNA聚合酶η蛋白表達(dá)差異與TP方案治療患者遠(yuǎn)期療效的關(guān)系

截至2010年3月31日，隨訪50例患者中位生存時(shí)間為（23.5±5.1）個(gè)月，其中DNA聚合η蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性組中位生存時(shí)間為（15.7±3.6）個(gè)月，陽性組為（18.5±2.7）個(gè)月，陰性組為（28.3±1.9）個(gè)月，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

卵巢癌的臨床診療過程具有早發(fā)現(xiàn)困難、術(shù)后易復(fù)發(fā)、對(duì)化療中度或低度敏感的特點(diǎn)，目前的臨床治療主要包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)以及化療藥物聯(lián)合治療兩種手段。該類患者近20年的治療后5年生存率在40%左右。

鉑類藥物屬于影響細(xì)胞DNA合成的周期非特異性抗腫瘤藥物，具有廣譜、對(duì)實(shí)體瘤尤其是對(duì)一般化療不敏感的腫瘤效果顯著的特點(diǎn)。目前，對(duì)初次治療的上皮性卵巢癌的有效率可以達(dá)到50%左右，是目前一線化療方案中的重要治療藥物。

鉑類藥物的耐藥現(xiàn)象一直是臨床工作者與科研工作保持高度重視的問題之一。也是導(dǎo)致腫瘤患者無法完成系統(tǒng)化療的重要原因之一。從藥物的作用機(jī)制反推耐藥發(fā)生的機(jī)制，并尋求解決的方案是目前探討鉑類耐藥的重要研究方向。從作用機(jī)制來看，鉑類藥物是通過破壞細(xì)胞中的DNA雙鏈發(fā)揮細(xì)胞毒作用。目前的研究已經(jīng)明確，細(xì)胞自身存在修復(fù)機(jī)制對(duì)抗藥物的破壞進(jìn)程。如果修復(fù)的機(jī)制強(qiáng)于藥物的破壞進(jìn)程，細(xì)胞將顯現(xiàn)出對(duì)藥物的敏感性降低，甚至是引發(fā)耐藥現(xiàn)象的發(fā)生[9]。DNA聚合η蛋白是細(xì)胞修復(fù)過程中重要的蛋白，尤其是對(duì)于存在結(jié)構(gòu)破壞的DNA的修復(fù)[10]。

基于以上背景，筆者開展了本次研究。從細(xì)胞水平以及臨床觀察兩個(gè)方面對(duì)于DNA聚合η蛋白在順鉑耐藥現(xiàn)象中發(fā)揮的作用進(jìn)行探討。在體外研究水平，筆者將目的基因表達(dá)使用沉默的方法加以抑制，觀察目的基因表達(dá)與細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性的影響。結(jié)果顯示，未進(jìn)行目的基因沉默的OVCR3細(xì)胞以及基因沉默的OVCR3細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性差異明顯，順鉑對(duì)上述兩種細(xì)胞的IC50分別為（46.66±2.23）μmol/L、（30.21±3.09） μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。該結(jié)果的得出可以明確DNA聚合η蛋白編碼基因的表達(dá)能夠明顯影響細(xì)胞對(duì)于順鉑藥物的敏感性，且其表達(dá)的下調(diào)能夠增加細(xì)胞的藥物敏感性。從機(jī)制上分析，目的基因的沉默將直接導(dǎo)致后續(xù)相應(yīng)功能蛋白的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致能夠發(fā)揮修復(fù)作用的DNA聚合η蛋白的表達(dá)下降，并直接導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)于藥物敏感性的增加。在體外研究的基礎(chǔ)上，筆者使用免疫組化的方法觀察不同患者病理組織的DNA聚合η蛋白的表達(dá)。結(jié)果提示，不同患者間目的蛋白的表達(dá)存在明顯差異，且蛋白表達(dá)的差異與藥物的近期療效呈現(xiàn)相關(guān)性。其中，聚合酶表達(dá)強(qiáng)陽性組有效率為46.2%，陽性組有效率為60.0%，陰性組有效率為83.3%，三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)合遠(yuǎn)期療效觀察，隨訪50例患者中位生存時(shí)間為（23.5±5.1）個(gè)月，其中DNA聚合η表達(dá)強(qiáng)陽性組中位生存時(shí)間為（15.7±3.6）個(gè)月，陽性組為（18.5±2.7）個(gè)月，陰性組為（28.3±1.9）個(gè)月，三組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。臨床觀察的結(jié)果顯示DNA聚合η蛋白表達(dá)相對(duì)較低患者，藥物治療的有效率以及患者的生存期均較高。從臨床水平能夠一定程度的驗(yàn)證DNA聚合η蛋白的表達(dá)下降，細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性增高的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本次觀察，分別使用基因沉默技術(shù)以及免疫組化的方法，分別從體外細(xì)胞水平以及體內(nèi)臨床觀察兩個(gè)層面驗(yàn)證了DNA聚合η蛋白對(duì)于腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性以及化療藥物療效之間的關(guān)系，提示DNA聚合η蛋白的表達(dá)下調(diào)，能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。上述結(jié)論為制藥企業(yè)開發(fā)新的化療藥物位點(diǎn)以及臨床醫(yī)生制訂治療模式提供了前期的基礎(chǔ)性研究。

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