孕期脂多糖刺激誘導(dǎo)子代大鼠高血壓的機制研究

郝雪琴,孔 濤,李曉輝

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院藥理學(xué)教研室,洛陽 471003;2.第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,重慶 400038)

孕期脂多糖刺激誘導(dǎo)子代大鼠高血壓的機制研究

郝雪琴1,2#,孔 濤1,李曉輝2△

(1.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院藥理學(xué)教研室,洛陽 471003;2.第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,重慶 400038)

目的探討孕期脂多糖刺激誘導(dǎo)子代大鼠(簡稱子鼠)高血壓的機制研究。方法將SD孕鼠6只隨機分為兩組。對照組 3只:腹腔注射無菌生理鹽水 0.5 mL;脂多糖組 3只:腹腔注射脂多糖,劑量為 0.79 mg/kg。分別在孕期第8、10、12天08∶00～09∶00進行腹腔注射。子鼠出生后,觀察7～25周齡子鼠血壓的變化和腎組織腎素mRNA表達、血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1-R)的蛋白表達以及腎組織血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)陽性細胞表達。結(jié)果與對照組相比,脂多糖組子鼠血壓逐漸升高,至24周齡時達到高血壓水平。血漿腎素活性和AngⅡ濃度無變化。7、16、25周齡子鼠腎內(nèi)腎素mRNA表達和AngⅡ陽性細胞數(shù)與對照組相比明顯增高,并與血壓呈正相關(guān);AT1-R的蛋白表達與對照組相比降低,與腎素mRNA表達呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論孕期暴露于脂多糖引起子代成年大鼠腎組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增高,這可能是血壓升高的一個機制。

炎癥;脂多糖類;腎素-血管緊張素系統(tǒng);高血壓

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型制備 SPF級SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實驗動物中心,動物實驗合格證號:SCXK(渝)2002003。成年雌雄大鼠按 4∶1合籠交配,室溫[(24±1)℃]環(huán)境下喂養(yǎng)。分別于合籠次日 07∶00與19∶00做雌鼠陰道檢查,有陰道栓或陰道涂片精子呈陽性者定為妊娠第0天。選取6只孕鼠隨機分為兩組。對照組3只:腹腔注射無菌生理鹽水0.5 mL;脂多糖組3只:腹腔注射脂多糖,劑量為0.79 mg/kg。分別在孕期第8、10、12天08∶00～09∶00進行腹腔注射,注射后輕柔腹部片刻,促進藥物吸收。

1.2 血壓的測定 子鼠血壓的測定從7周齡開始,每3周測1次至25周齡。采用尾套法大鼠尾動脈血壓測定方法[6]。均在15∶00～18∶00進行,具體操作如下:在安靜環(huán)境下,保持室溫 25℃,測壓前在 40℃條件下將大鼠預(yù)熱 10 min,放于固定裝置中,待大鼠安靜后,將尾動脈無創(chuàng)測量儀的尾部氣囊和脈搏換能器依次套于大鼠尾部近心端,換能器表面對準(zhǔn)尾腹面,尾部氣囊與換能器均通過生理四通道信號采集儀連于電腦,調(diào)整鼠尾和換能器接觸部位,待收集信號穩(wěn)定后,充氣加壓,直到脈搏信號成為一條直線,此時大鼠尾動脈血流被完全阻斷,然后逐漸放氣減壓,待脈搏信號出現(xiàn)規(guī)則波形,電腦中與氣囊相連所采集的信號與脈搏信號第一波同步所指示的壓力值,即為大鼠尾動脈收縮壓。每只大鼠每隔3 min測1次,連續(xù)測 3次,取平均值。

1.3 標(biāo)本的采集 子鼠出生后,母乳喂養(yǎng)1個月后給予實驗大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),分別在7、16、25周齡時處死取腎臟用于檢測腎素mRNA表達及血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1-R)的蛋白表達,并用免疫組織化學(xué)法檢測血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)表達陽性細胞。

1.4 real-time PCR檢測腎組織腎素mRNA的表達 總RNA的提取采用T rizol法,用一步法 cDNA合成試劑盒(東洋紡有限公司生化業(yè)務(wù)部)在 Thermo Hybaid PXL上進行反轉(zhuǎn)錄。所有引物應(yīng)用Premier 5.0軟件設(shè)計,由上海生工合成,以βactin作為內(nèi)參照。引物序列為大鼠腎素(正義鏈:5′-GGG TGC TAA AGG AGG AAG TGT T-3′,反義鏈:5′-AGT GAA AGT TGC CCT GGT AAT G-3′)、大鼠 β-actin(正義鏈:5′-GAC GTT GAC ATC CGT AAA GAC C-3′,反 義鏈:5′-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3′)。 real-time PCR 采用20 μ L反應(yīng)體系,應(yīng)用綠色熒光定量聚合酶鏈反應(yīng),反應(yīng)條件:95℃2 min,95℃10 s,59℃15 s,循環(huán) 40次,然后72℃20 s[7]。

1.5 Western blot檢測腎組織AT1-R的蛋白表達 提取腎臟總蛋白,用考馬斯亮藍G250比色法測定蛋白質(zhì)濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),濕轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗AT1-R抗體(1∶1 000,Abzoom,USA)4℃孵育過夜,含0.1%Tween的 TBS緩沖液(TBST,30 mL)洗膜5次,每次10 min;二抗山羊抗兔 IgG(1∶2 000,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育1 h,含0.1%Tween的TBS緩沖液(TBST,30 mL)洗膜5次,每次10 min;PVDF條帶浸入ECL化學(xué)發(fā)光液(美國Pierce公司,A、B液1∶1混合)發(fā)光5 min后暗室進行曝光、顯影。β-actin抗體(1∶5 000,Sigma公司,USA)4℃孵育過夜[8],其他處理方法同上。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測腎組織AngⅡ表達陽性細胞 標(biāo)本用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切成4 μ m厚切片,脫蠟至水,胃蛋白酶消化液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)37℃作用10 min,0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次5 min,0.1 mol/L PBS洗3次,每次5 min。3%過氧化氫作用15 min,PBS洗3次,每次5 min。5%牛血清蛋白(BSA)封閉 15 min。滴加一抗AngⅡ 抗體(1∶100,Chemicon公司,Canada)4℃作用12 h,0.1 mol/L PBS洗3次,每次 5 min。滴加山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)37℃孵育30 min,PBS洗3次,每次 5 min。DAB顯色。Ang-Ⅱ陽性細胞細胞質(zhì)呈棕褐色染色。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠尾動脈血壓變化 從7周齡開始,脂多糖組子鼠平均動脈壓呈持續(xù)增高趨勢,明顯高于對照組(P＜0.01)。25周齡時,脂多糖組子鼠平均動脈壓已經(jīng)達到142 mm Hg,明顯高于對照組的114 mm Hg(P＜0.01),見圖1。

2.2 腎組織腎素mRNA表達 7、16、25周齡脂多糖組子鼠腎素mRNA的表達明顯高于對照組,并有隨年齡增長而逐漸增高的趨勢(P＜0.01),見圖2。

2.3 腎組織AT1-R蛋白的表達 7、16、25周齡脂多糖組子鼠腎皮質(zhì)AT1-R蛋白的表達比對照組顯著降低(P＜0.01),見圖3。

2.4 AngⅡ在腎組織中的表達 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示AngⅡ主要表達在近端小管上皮細胞,見封 3圖 4;7、16、25周齡脂多糖組子鼠腎臟AngⅡ組陽性表達細胞數(shù)明顯高于對照組,見圖5。

圖1 兩組子鼠平均動脈血壓比較

圖2 兩組子鼠腎素mRNA表達的比較

圖3 兩組子鼠腎組織AT1-R蛋白表達的比較

圖5 兩組子鼠腎臟AngⅡ陽性細胞數(shù)比較

3 討 論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)是一個激素的級聯(lián)反應(yīng),對動脈血壓和血管容量的維持、組織灌注起著重要的調(diào)節(jié)作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)由腎素分泌啟動,催化血管緊張素原氨基端水解生成血管緊張素Ⅰ(AngⅠ),AngⅠ又被血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水解生成AngⅡ。AngⅡ是一強效的血管收縮劑,是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要活性成分,在高血壓的發(fā)生、發(fā)展以及靶器官的損害中起著十分重要的作用[9-12]。

本研究成功地復(fù)制了孕期暴露于脂多糖引起子鼠高血壓的模型,并發(fā)現(xiàn)腎皮質(zhì)腎素活性和AngⅡ陽性細胞數(shù)與血壓的升高呈正相關(guān),表明腎素-血管緊張素活性的增高參與了孕期暴露于脂多糖引起的血壓增高。前期有研究表明孕期脂多糖引起子鼠腎臟發(fā)育異常,腎小球減少。因此,可能的機制是殘余的腎小球超負(fù)荷工作引起腎小球肥大,激活了腎素-血管緊張素系統(tǒng),導(dǎo)致血壓增高[13-14]。

本研究中腎臟AngⅡ陽性細胞數(shù)與血壓升高呈正相關(guān),這與以往研究結(jié)果一致。在對鹽敏感性高血壓的研究中發(fā)現(xiàn),血壓的升高與腎臟AngⅡ呈正比,而與血漿AngⅡ濃度呈負(fù)相關(guān),而且,腎臟AngⅡ與腎組織 AngⅡ陽性細胞數(shù)呈正相關(guān)[10]。這表明腎組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活性在高血壓的發(fā)生中起著重要的作用。

腎組織AT1-R的蛋白表達與腎素活性和血壓的增高呈負(fù)相關(guān),可能的原因是腎素的增高誘導(dǎo)了AngⅡ受體的下調(diào),是機體負(fù)反饋調(diào)節(jié)的結(jié)果。

總之,孕期暴露于脂多糖引起子鼠腎組織腎素-血管緊張素活性增高,AT1-R受體密度下調(diào),為高血壓的防治提供了新的思路。

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Effects of maternal lipopolysaccharide on intrarenal renin-angiotensin system in offspring rats

Hao Xueqin1,2#,Kong Tao1,Li Xiaohui2△
(1.Departmentof Pharmacology,Animal Science and Technology College,HenanUniversity of Science and Technology,Luoyang,Henan 471003,China;2.Department of Pharmaceutics,Pharmaceutical College,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

ObjectiveTo explore the mechanism of hypertension caused by maternal exposure to lipopolysaccharide in adult offspring rats.MethodsNulliparous,pregnant,time-matched SD rats were randomly divided into two groups(n=3):control group and LPS group.On the pregnant day 8,10 and 12,rats in control group and LPS group were administered intraperitoneally with saline 0.5 mL or LPS 0.79 mg/kg,respectively.The systolic blood pressure was measured in offspring once three weeks from 7 weeks of age to 25 weeks of age.The plasma renin activity and angiotensin II concentration were measured in adult offspring rats at 7,16 and 25 weeks of age,intrarenal renin was assessed by real-time PCR,A T1-R protein expression was assessed by Western blot and angiotensinⅡ-positive cells were determined with immunohistochemical staining.ResultsThe blood pressure in offspring of LPS-treated rats increased constantly and reached hypertensive level at 24 weeks of age.The intrarenal renin mRNA expression and the number of angiotensinⅡ-positive cells increased at 7,16 and 25 weeks of age,while the AT1-R protein expression decreased.The plasma renin activity and angiotensinⅡwere unchanged.ConclusionMaternal exposure to lipopolysaccharide activates intrarenal renin-angiotensin system in adult offspring rats.

inflammation;lipopolysaccharides;offspring,renin-angiotensin system;hypertension心血管疾病是當(dāng)今威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一,其發(fā)病率和病死率已超過腫瘤而躍居第一。高血壓是心血管疾病最主要的危險因素之一,其根本病因目前已知的有遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥因素、精神因素等。近年來許多研究表明,生命早期刺激可引起子代大鼠(簡稱子鼠)高血壓[1-5]。既往有研究表明孕期暴露于脂多糖或酵母多糖(zymosan)引起子代成年大鼠高血壓,但其機制尚不清楚[6]。本研究通過模擬孕期暴露于脂多糖引起子鼠高血壓的模型,研究腎臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)在孕期暴露于脂多糖引起的子鼠高血壓中的作用。

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.05.012

A

1671-8348(2011)05-0445-03

△通訊作者,Tel:(023)68752318;E-mail:lpsh008@yahoo.com.cn。#博士。

2010-06-09

2010-08-22)

·論 著·