血經(jīng)草總黃酮的提取工藝研究

于春月 ，張?zhí)亓?，劉新華 ，劉金杰 .哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)系，黑龍江大慶 6339；.大慶市人民醫(yī)院，黑龍江大慶 6336

血經(jīng)草總黃酮的提取工藝研究

于春月1，張?zhí)亓?，劉新華1，劉金杰11.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)系，黑龍江大慶 163319；2.大慶市人民醫(yī)院，黑龍江大慶 163316

目的：優(yōu)選血經(jīng)草中總黃酮的最佳提取工藝。方法：以蘆丁為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察黃酮提取率，通過正交試驗(yàn)對(duì)回流法提取黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：回流提取法的最佳工藝條件為，以1 g血經(jīng)草為原料，100ml 60%乙醇為溶劑提取，提取時(shí)間為2 h，提取次數(shù)為1次；在該條件下，總黃酮的提取率為1.56%，RSD為1.43%（n=5）。結(jié)論：本工藝合理、可行。

血經(jīng)草；分光光度法；黃酮；正交試驗(yàn)；提取工藝

血經(jīng)草為報(bào)春花科排草屬植物狼尾珍珠菜Lysimachia barystachys Bunge.的全草[1]，有活血調(diào)經(jīng)，散瘀消腫，利水降壓的作用，多用于治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、咽喉腫痛等癥。研究表明，血經(jīng)草的主要成分為黃酮類物質(zhì)，包括槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷等[2]。目前關(guān)于血經(jīng)草的相關(guān)研究較少，總黃酮的提取工藝研究更是鮮見報(bào)道。本文通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了回流提取法中各因素對(duì)于血經(jīng)草總黃酮提取率的影響，旨在通過確立最佳提取工藝，為血經(jīng)草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

756 MC型紫外-可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；UV-7504PC紫外可見分光光度計(jì) （上海欣茂儀器有限公司）；ESJ萬分之一電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）。

1.2 試藥

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 （中國藥品生物制品檢定所批號(hào)：100080-200707），其他試劑均為分析純。血經(jīng)草全草采自大慶市哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)附近，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)系劉金杰教授鑒定為報(bào)春花科植物狼尾珍珠菜Lysimachia barystachys Bunge.，洗凈后放入烘箱60℃干燥，粉成粗粉，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用60%乙醇溶液定溶于50ml量瓶中，配成濃度為0.2mg/ml的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取血經(jīng)草全草1 g，用100 ml 60%乙醇回流提取1 h，放冷，過濾，備用。

2.2 檢測(cè)波長的選擇

取對(duì)照品溶液3ml，置于10ml量瓶中，加60%乙醇成5m l，加 5%NaNO2溶液 0.3 m l，放置 6 min；加 10%Al（NO3）3溶液0.3ml，放置 6 min；加 1mol/m l NaOH 溶液 4ml，加 60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min后，在紫外可見分光光度計(jì)上，于400～600 nm處測(cè)定最大吸收波長，最終確定為510 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[3]

精密量取對(duì)照品溶液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml于 6只10ml量瓶中，分別用60%乙醇補(bǔ)充至5 ml，加5%NaNO2溶液 0.3ml，放置 6min；加 10%Al（NO3）3溶液 0.3ml，放置 6min；加1 mol/ml NaOH溶液4ml，加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min后，以0.0 m l為空白對(duì)照，在510 nm處測(cè)定吸光度。以對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為A=13.659C-0.0011（r=0.999 9，n=5）。結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品在濃度為0.05～0.08mg/m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

取上述供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定6次吸光度，并設(shè)立空白對(duì)照，結(jié)果RSD=0.99%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，分別放置0 min、20min、40min、60min、1 h、2 h、3 h、4 h 后測(cè)定吸光度，結(jié)果在1 h內(nèi)RSD＜2%，表明樣品不穩(wěn)定，應(yīng)在1 h內(nèi)測(cè)量。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取上述藥材樣品，按照樣品溶液制備方法平行制備6份，依法測(cè)定，RSD=1.91%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)[4]

向已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的樣品提取液中加入一定量的蘆丁對(duì)照品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示平均回收率為101.8%，RSD=2.11%，表明該法回收率良好。

2.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[5-6]

采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，對(duì)回流提取法提取血經(jīng)草中總黃酮的影響因素進(jìn)行了考察，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogona l test

2.9 樣品含量測(cè)定

取血經(jīng)草粉末約1 g，置于100 m l圓底燒瓶中回流提取，按“2.8”項(xiàng)下方法進(jìn)行正交試驗(yàn)。精密吸取濾液3 ml于10m l量瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法操作進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，并計(jì)算總黃酮提取率，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可知，以血經(jīng)草為原料回流提取總黃酮各因素對(duì)黃酮提取率的影響順序?yàn)椋篋＞C＞B＞A，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞乙醇用量＞乙醇濃度。最佳工藝為A1B3C3D1，即60%乙醇100m l，回流提取2 h，提取1次；在該條件下，黃酮提取率為 1.56%，RSD=1.43%（n=5）。

3 討論

正交試驗(yàn)部分先采用單因素法確立最佳水平范圍，后采用多因素法考察整體影響度，這樣就避免了關(guān)鍵水平點(diǎn)被漏掉的錯(cuò)誤發(fā)生，從而使整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更具有科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

硝酸鋁顯色法測(cè)定總黃酮的原理是：鋁離子與黃酮母核中的3位（或5位）上的羥基和4位羰基配合成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而可用比色法進(jìn)行測(cè)量。血經(jīng)草中報(bào)道的化學(xué)成分包括槲皮素、蘆丁、山奈酚、金絲桃苷以及一些黃酮苷類成分，它們結(jié)構(gòu)中都普遍具有3位（或5位）羥基，因此選用此法進(jìn)行含量測(cè)定。同時(shí)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中以蘆丁、槲皮素及山奈酚的混合溶液作為對(duì)照品溶液，在血經(jīng)草全草的HPLC圖譜中顯示，蘆丁含量最高且分離度好，故選用蘆丁作為對(duì)照品溶液。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of orthogonal test

由于樣品溶液顯色后有大量絮狀沉淀出現(xiàn)，故采用先過濾后測(cè)定的方法進(jìn)行含量測(cè)定，但顯色后穩(wěn)定性稍差，建議在1 h內(nèi)測(cè)量完成。

[1]全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1975.

[2]萬近福,袁琳,譚寧華,等.虎尾草化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2009,21:966-969.

[3]謝明德,吳娟,彭括,等.櫻草杜鵑黃酮類成分的提取工藝研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2010,7(18):67-68.

[4]李春紅,潘宏,何兵,等.香椿葉中槲皮素和山奈酚的同板薄層鑒別及總黃酮的含量測(cè)定[J].瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,33(3):247-249.

[5]黃頌,李枝端.Excel在L9(34)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理改進(jìn)中的應(yīng)用[J].中國藥房,2007,18(22):1752-1753.

[6]努爾阿米娜·阿尤甫,阿不都拉·阿巴斯.曼陀羅種子種總黃酮含量測(cè)定及提取工藝的研究[J].食品科學(xué),2008,29(3):260-263.

Study on optimal technology for extracting flavonoids from Lysimachia barystachys Bunge.

YUChunyue1,ZHANGTeli2,LIUXinhua1,LIUJinjie1

1.Department of Pharmacy,Daqing Campus of Harbin in Medical University,Daqing 163319,China;2.People's Hospital of Daqing,Daqing 163316,China

Objective:To optimize the bestextraction technology of Flavonoids in Lysimachia barystachys Bunge..Methods:Optimize the extraction technology on indexes of rutin content and the extraction ratio of Flavonoids by orthogonal test.Results:The optimal condition of extraction technology as follows:100 ml ethanolwith the concentration of 60%per gram of Lysimachia barystachys Bunge.,extraction time of 2 h，extraction times of 1 time;in this condition,the extraction rate of flavonoidswas1.56%with a RSD of 1.43%(n=5).Conclusion:The extraction technology is reasonable and practical.

Lysimachia barystachys Bunge.;Spectrophotometry;Flavonoids;Orthogonal design;Extracting technology

R284.2

A

1673-7210（2011）03（b）-060-02

黑龍江省衛(wèi)生廳科技項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2007-491）。

于春月（1979-），女，碩士學(xué)歷，主要從事天然藥物化學(xué)成分研究。

2011-01-10）